ПРАКТИКУМ З ГІСТОЛОГІЇ, ЦИТОЛОГІЇ ТА ЕМБРІОЛОГІЇ - 2016

Розділ 1. ГІСТОЛОГІЧНА ТЕХНІКА.

Будова мікроскопа i правила роботи з ним

Основним методом дослідження гістологічних препаратів є мікроскопічний.

Мікроскоп - це оптичний прилад, за допомогою якого ми отримуємо збільшені зображення біологічних об'єктів і деталі їхньої будови, яких не видно неозброєним оком.

Мікроскоп складається з оптичних і механічних частин. До оптичних належать: об'єктиви, окуляри, дзеркало, конденсор з ірисовою діафрагмою; до механічних - основа, тубусотримач, тубус, револьвер, предметний столик, механізми макро- і мікрогвинта, механізми переміщення конденсора.

Оптичні частини мікроскопа

Об'єкт у мікроскопі звичайно розглядають у прохідному світлі через об'єктив і окуляр. Хід променів у світловому мікроскопі показано на рис.2. Промені від джерела світла (1) проходять через конденсор (2), об'єкт (3) до лінз об'єктива (4) і окуляра (5), і далі до ока спостерігача, будуючи проміжне (6) і остаточне зображення (7). Об'єктив і окуляр мікроскопа складаються з системи закріплених у металеві оправи лінз.

Лінзи мікроскопа мають здатність збільшувати зображення. Збільшення - це властивість розсувати промені, які прямують від об'єктива. Воно визначається відношенням лінійних розмірів зображення до лінійних розмірів об'єкта. Збільшення залежить від кривизни лінз: чим більша кривизна, тим більше збільшення.

Рис.2. Принципова схема світлового мікроскопа.

Відповідно, чим більша кривизна, тим менший діаметр i коротша фокусна відстань. Загальне збільшення мікроскопа (добуток збільшень об'єктива і окуляра) становить для світлооптичного мікроскопа близько 1500 разів.

Лінзи також забезпечують чіткість зображення, яка залежить від ступеня вираженості основних оптичних недоліків лінзи - сферичної і хроматичної аберацій.

Сферична аберація - це більш сильне заломлення променів, які проходять через периферійні зони лінзи, порівняно з тими, що пройшли через її центральні ділянки. Через сферичну аберацію зображення деталей стають нечіткими. Зменшити сферичну аберацію можна шляхом діафрагмування.

Хроматична аберація - це розкладання лінзою білого кольору на спектр унаслідок неоднакового заломлення променів із різною довжиною хвилі. Це призводить до спотворення кольору і зменшення чіткості зображення. Усунення або ослаблення хроматичної аберації можливе при виготовленні лінз із різних видів оптичного скла, які мають неоднакові показники заломлення.

Лінзи характеризуються також роздільною здатністю - найменшою відстанню між двома точками об'єкта, при якій ми їх бачимо окремо. Роздільна здатність (d) визначається за формулою , де λ - довжина хвилі світла, при якому спостерігаємо об'єкт; n - показник заломлення середовища між об'єктом і об'єктивом; α - кут між оптичною віссю об'єктива і найбільш відхиленим променем, який потрапляє в об'єктив.

Величина n · sіn α є важливою оптичною характеристикою і називається числовою апертурою об'єктиву. Роздільна здатність світлооптичного мікроскопа становить приблизно 0,2 мкм і є наближеною до теоретично можливої.

Об'єктив (1) - основна оптична частина мікроскопа (рис.3). Він складається з системи лінз у металевій оправі, які збільшують зображення препарата. Розрізняють фронтальну лінзу, найближчу до об'єкта, яка будує зображення, і верхню лінзу, найближчу до ока, яка усуває аберації фронтальної лінзи.

У біологічному мікроскопі системи МБД-1 є три об'єктиви: малого збільшення, великого збільшення та імерсійний. Об'єктив характеризується власним збільшенням, числовою апертурою, фокусною відстанню та іншими константами. Звичайно, на об'єктиві викарбувані перші дві характеристики. На об'єктиві малого збільшення — 8 х і 0,20; великого збільшення — 40 х і 0,65; імерсійному (масляному) — 90 х і 1,25. Об'єктив малого збільшення відрізняється від об'єктива великого збільшення також меншою довжиною металевої оправи і більшим діаметром фронтальної лінзи. Об'єктиви розміщуються на нижньому кінці тубуса (2) у револьвері (3) (рис.3).

Окуляр - друга за значенням оптична частина мікроскопа - знаходиться у верхній частині тубуса (4). Окуляр використовується для розгляду зображення, побудованого об'єктивом. Простий окуляр (Гюйгенса) складається з двох лінз у металевій оправі. Між лінзами міститься діафрагма з постійним круглим отвором. Верхня лінза називається очною. На її оправі написане збільшення окуляра - 7х, 10х, 15х тощо. Нижня лінза окуляра називаться польовою. Щоб визначити загальне збільшення мікроскопа, треба збільшення об'єктива помножити на збільшення окуляра.

Дзеркало (5) спрямовує промені світла до конденсора і має плоску і вігнуту поверхні. Дзеркало закріплюється в нижній частині штатива і може обертатися навколо своєї осі. Дзеркало збирає промені від джерела світла і направляє через конденсор на препарат знизу. Вігнуте дзеркало дає більш концентрований пучок світла.

Рис.З. Будова мікроскопа

При наявності конденсора при малому збільшенні використовується вігнута поверхня дзеркала, при великому - плоска, при відсутності конденсора - навпаки.

Конденсор (2) збирає промені світла і фокусує їх на препараті, забезпечуючи тим самим його достатнє і рівномірне освітлення. Конденсор складається з двох лінз, умонтованих у спільну оправу. Лінзи закріплені в оправі спеціальним гвинтом конденсора. Кільце (оправа) з'єднане з ірис-діафрагмою, яка знаходиться під конденсором. Звуження або розширення отвору діафрагми здійснюється спеціальним важелем діафрагми, розташованим збоку

від неї. Ще нижче розміщується кільце для світлофільтру. Звичайно, у комплекті до мікроскопа додаються два світлофільтри: матовий, без кольору, і матово-синій, застосування якого наближає спектр електричного освітлення препарата до денного.

Конденсор, діафрагма і світлофільтр можуть опускатися і підніматися завдяки обертанню гвинта, який розташовується біля них із правої сторони (6,а).

Механічні частини мікроскопа

Штатив мікроскопа складається з підставки (основи), тубусотримача (колонки), тубуса, револьвера, макро- і мікрометричного гвинтів.

Підставка, або основа штативу, (7) має підковоподібну або прямокутну форму, щоб надати мікроскопу стійкості.

Тубусотримач (колонка штативу) (8) у нижній частині з'єднаний із коробкою мікромеханізмів і містить на собі макрометричний (9) і, попереду від останнього, - мікрометричний (10) гвинти, а також гвинт конденсора.

У верхній частині колонка закінчується головкою (11), яка має форму косо зрізаного циліндра. Знизу до головки рухомо прикріплюється револьверна система (3) із гніздами для об'єктивів.

При повороті рукою револьвер дає можливість міняти об'єктиви, необхідні для вивчення мікропрепарата. Угорі головка має одне велике гніздо з нарізкою, в яке, у разі необхідності, можна вставляти фото- або бінокулярну (із двома тубусами) насадку. Насадки закріплюються в гнізді гвинтом, який розташований збоку на головці тубусотримача.

Колонка може також використовуватись як ручка при переносі мікроскопа.

Тубус або труба (2) потрібен для розміщення окуляра. У сучасних мікроскопах тубус нахилений під кутом до предметного столика. Переміщення вгору і донизу досягається повертанням двох гвинтів - макрометричного і мікрометричного.

Макрометричний гвинт або кремальєра (9) - це гвинт для швидкого, грубого переміщення тубуса до отримання чіткого зображення досліджуваного об'єкта. Гвинт має дві ручки у вигляді коліс по обидва боки мікроскопа. Гвинт можна рухати за і проти годинникової стрілки. Макрогвинт розташований у нижній частині так, щоб, користуючись ним, не треба було відривати руку від робочого стола.

Мікрометричний гвинт (10) служить для подальшої більш

чіткої і виразної установки на фокус. Він пересуває тубус на маленьку відстань, тому його не можна і не потрібно сильно обертати. Один оберт ручки гвинта відповідає переміщенню тубуса на 0.1 мм.

Макрогвинт і мікрогвинт при обертанні від спостерігача, тобто, за годинниковою стрілкою, опускають лінзи до препарату. При обертанні в напрямку до спостерігача, тобто, проти годинникової стрілки, гвинти піднімають тубус, віддаляючи лінзи від препарату.

Предметний столик (12) потрібен для розміщення на ньому мікропрепарату. У центрі столика знаходиться круглий отвір, через який проходять промені світла від дзеркала і освітлюють препарат знизу. У предметному столику є два маленьких отвори, куди вставляються металеві пружні пластинки - клеми, затискачі - для фіксації мікропрепарату до столика.

Столики бувають нерухомі (квадратні) і рухомі (круглі). Останні пересуваються за допомогою двох гвинтів діагонального переміщення, які розташовані на бічних поверхнях столика з правої і лівої сторони. Більш дозаду від правого гвинта міститься ще один гвинт - стопор обертання столика. Коли він загвинчений, предметний столик не рухається.

Правила користування мікроскопом

1. Мікроскоп переносять, тримаючи однією рукою за колонку, а другою - підтримуючи основу.

2. Мікроскоп розміщують на робочому місці так, щоб колонка була біля спостерігача, а дзеркало було спрямоване до джерела світла. Зошит для зарисовки слід покласти з правої сторони.

3. Перевірити револьвер мікроскопа, поставити об'єктив малого збільшення (8х) і за допомогою макрогвинта наблизити його нижній край на відстань 1 см від предметного столика.

4. Встановити освітлення, повертаючи дзеркало до такого положення, коли все поле мікроскопа буде освітлене рівномірно і достатньо інтенсивно. Встановлення освітлення контролювати, дивлячись в окуляр лівим оком.

5. На предметний столик помістити мікропрепарат покривним склом догори. Зріз повинен знаходитися над отвором столика.

6. Обертаючи макрогвинт, знайти чітке зображення структур органа або тканини на зрізі, підібрати ділянку для вивчення, поставити її в центр поля зору мікроскопа. Після цього мікропрепарат можна закріпити клемами.

7. При необхідності переходу на велике збільшення треба: підняти тубус мікроскопа обертанням макрогвинта на себе, плавним

рухом повернути револьвер i встановити об'єктив великого збільшення (40х), почувши при цьому клацання. Далі, дивлячись збоку на мікроскоп, обертати макрогвинт від себе, поки фронтальна лінза об'єктиву максимально наблизиться до покривного скла мікропрепарату. Після цього, дивлячись в окуляр, дуже повільно обертати макрогвинт на себе, поки не з'явиться більш-менш чітке зображення. Слід за цим перейти до повільного обертання мікрогвинта до появи чіткого зображення. Необхідно пам'ятати, що необережним рухом можна розчавити мікропрепарат.

8. У разі переходу до вивчення іншої ділянки мікропрепарата, слід повернутися до малого збільшення і повторити пп. 6 і 7.

9. Розглянути і вивчити препарат при великому збільшенні і приступити до його зарисовки.

10. Після закінчення роботи з мікроскопом встановлюють об'єктив малого збільшення.