ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ - Е. Ю. Тюменцева - 2015

ТЕМА 9. МИКРОБИОЛОГИЯ НЕПРОДОВОЛЬСТВЕННЫХ ТОВАРОВ

Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям СанПиНа 2.1.4.1074-01 на питьевую воду.

Для оценки санитарного состояния воды в ней определяют общее микробное число - не более 50 КОЕ/см³; термотолерантные колиформные бактерии - не допускаются в 100 см³; общие колиформные бактерии также должны отсутствовать в 100 см³; споры сульфитредуцирующих клостридий - не допускаются в 20 см³;

колифаги - в 100 см³. Исследование питьевой воды проводят один раз в квартал при пользовании городским водопроводом и один раз в месяц при наличии собственных источников водоснабжения в воде.

Общее микробное число воды (ОМЧ) - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при 37 °С в течение 24 часов.

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при температуре 37 °С в течение 24 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, которые кроме этого способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре 44 °С в течение 24 часов.

Сульфитредуцирующие клостридии (преимущественно Clostridium perfringens) - спорообразующие анаэробные палочковидные бактерии, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре в течение 24 часов при температуре 44 °С.

Колифаги - бактериальные вирусы, способные лизировать кишечную палочку и формировать зоны лизиса через 18±2 часа при температуре 37 °С на ее газоне на питательном агаре. Колифаги - индикаторы очистки питьевой воды в отношении энтеровирусов.

Способами обеззараживания воды являются хлорирование, озонирование, обработка ультрафиолетовыми лучами.

Методика выполнения лабораторной работы

Цель работы: освоить микробиологические методы, позволяющие оценить санитарное состояние воды, тары, упаковочных материалов.

Материалы, реактивы, оборудование: термостаты; микроскопы; спиртовки; плитки; пробирки с тампонами для приготовления смывов; пинцет; пробирки со средой Кесслера; средой Кода; стерильные чашки Петри; стерильные пипетки на 1 см³; стерильные колбы на 500 см³; питательные среды: мясопептонный агар, среда Эндо, сусло-агар или среда Сабуро, лактозопептонная среда, железосульфитный агар; бактериологические петли; предметные стекла; чашки Петри; набор красок по Граму; фильтровальная бумага; мембранные фильтры; 96%-ный этиловый спирт.

Опыт № 1. Оценка санитарного состояния воды

а) Отбор проб. Кран или край спускной трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 минут воду спускают, после чего производят отбор пробы в стерильную колбу (объем пробы не менее 500 см3). Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой над огнем.

б) Определение общего микробного числа (КМАФАнМ). Проводят по методике, описанной в разделе 7.6.

Для посева отбирают по 1 см³ воды и переносят в 2 чашки Петри и заливают расплавленной и охлажденной до 45-50 °С плотной питательной средой (МПА). После инкубации посевов подсчитывают количество колоний в каждой чашке, а затем результаты суммируют и делят на два.

в) Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранных фильтров. Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации выросших колоний.

Для анализа точно отмеряют 100 см³ воды и фильтруют этот объем через стерильный мембранный фильтр. После окончания фильтрования фильтр осторожно приподнимают фламбированным пинцетом и переносят в чашку Петри со средой Эндо. Поверхность фильтра с осевшими на ней микроорганизмами должна быть

обращена вверх. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37 °С в течение 24 часов.

Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии, или выросли колонии с неровными краями и поверхностью.

При наличии типичных лактозоположительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде - темно-красных, красных с металлическим блеском, а также лактозоотрицательных - розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа.

Для идентификации отбирают не менее 5 колоний каждого вида и делают посев на скошенный питательный агар. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 16-18 часов. Далее проводят биохимические тесты с чистыми культурами: оксидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы при температуре 37 °С для определения общих колиформных бактерий и при 44 °С при определении термотолерантных колиформных бактерий.

г) Определение содержания общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом. Титрационный метод (метод бродильных проб) основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую накопительную среду, с последующим пересевом на дифференциальнодиагностическую среду для идентификации выросших колоний.

Титрационный метод может быть использован:

- при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом бродильных проб;

- при анализе воды с большим содержанием взвешенных частиц;

- в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Первый этап исследования заключается в посеве 3-х объемов

воды по 100 см³ в концентрированную лактозопептонную среду. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 часов для определения общих колиформных бактерий и при 44 °С - при определении термотолерантных колиформных бактерий в течение 24±2 часов. Если в колбах не обнаружены признаки роста (об этом судят по отсутствию газа в поплавках), то колиформные бактерии отсутствуют в 100 см³.

На втором этапе исследований из пробирок и колб, где отмечено наличие роста и образование газа, производят высев петлей в сектора среды Эндо. Посевы на среде Эндо выдерживают в термостате при 37 °С в течение 18-20 час. Отсутствие колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек, дает отрицательный ответ о содержании этих микроорганизмов в исследуемом объеме воды.

д) Определение споровых сульфитредуцирующих клостридий прямым посевом. Из каждой пробы воды делают посев 20 см³ в железосульфитный агар. Для этого в стерильные пробирки вносят по 10 см³ в 2 пробирки объемом 30 см или по 5 см в 4 пробирки вместимостью 15 см³. Посевы заливают горячим (75-80 °С) железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирки быстро охлаждают, помещая их в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при 44 °С в течение 24±2 часов. Если после культивирования не наблюдается почернения среды в пробирках, то считают, что сульфитредуцирующие клостридии

отсутствуют в 20 см³.

Опыт № 2. Контроль посуды и инвентаря

Для анализа санитарного состояния стеклянных бутылок и банок смыв делают путем обмывания внутренней поверхности последовательно 10 единиц посуды 20 см³ воды. Санитарное состояние бочек, бидонов, цистерн проверяют путем посева последней смывной воды. Смыв с мелкого инвентаря (мешалки, пробники, термометры и др.) готовят путем смачивания всей поверхности стерильным тампоном, а при анализе санитарного состояния стеллажей, лотков, ведер, лопат пользуются трафаретом. В смывах определяют общую бактериальную обсемененность и наличие кишечной палочки. Кишечная палочка должна отсутствовать в смывах.

Опыт № 3. Контроль упаковочных материалов

Пергамент, фольгу, пленку, комбинированные материалы для упаковки пищевых продуктов разворачивают и с внутренней стороны берут смыв, стерильным ватным тампоном (со 100 см3 поверхности). Определяют наличие микроскопических грибов и наличие кишечной палочки. Кишечная палочка в смывах должна отсутствовать, а содержание плесеней не должно превышать 5 в 1 см³ смыва.

Оформление и анализ результатов исследований

Выполнить микробиологические исследования и сделать выводы о микробиологической безопасности воды, упаковочных материалов, посуды и инвентаря.

После ознакомления с данной темой студенты могут оценивать микробиологическую безопасность воды, упаковочных материалов, посуды и инвентаря.

Контрольные вопросы

1. Какие микробиологические показатели определяются согласно ГОСТ в питьевой воде для оценки ее санитарного состояния?

2. Как часто проводят исследование питьевой воды для оценки ее санитарного состояния?

3. Каким образом готовятся смывы с оборудования для оценки его санитарного состояния?

4. Какие микробиологические показатели определяют в смывах с посуды?

5. Каким образом проводят микробиологический контроль упаковочных материалов?

6. Что такое ОМЧ?

7. Дайте определение колифагам.

8. Какие способы обеззараживания воды Вам известны?

9. Каким образом определяется коли-титр и коли-индекс в питьевой воде?

10. На чем основан титрационный метод определения содержания общих и колиформных бактерий?