БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ И БИОБЕЗОПАСНОСТЬ - А. П. Ермишин - 2015

ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ РАЗРАБОТКИ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ

Основоположником метода культуры изолированных клеток растений считают Г. Габерландта (G. Haberlandt, 1902). Он предложил концепцию культуры клеток растений in vitro,согласно которой клетки растений можно культивировать длительное время на питательной среде, содержащей раствор минеральных солей и органические добавки (Г. Габерландт использовал раствор Кнопа, глюкозу и пептон). Он показал, что для культивирования клеток растений необходимо соблюдать условия асептики, так как органические компоненты питательной среды могут метаболизироваться микроорганизмами. Более того, Г. Габерландт выдвинул гипотезу о тотипотентности растительной клетки, в соответствии с которой из культивируемых клеток можно регенерировать отдельные органы и даже целое растение.

Г. Габерландт

Г. Габерландт использовал для культивирования палисадные клетки паренхимы листа яснотки Lamium purpureum, сердцевины черешков листа водного гиацинта Eicchornia crassipes,гландулярных волосков медуницы Pulmonaria и крапивы Urtica, клетки тычинок традесканции Tradescantia и другой растительный материал. Им было показано, что изолированные клетки в культуре способны выживать в течение нескольких недель, синтезировать крахмал, увеличиваться в размере. Но ему не удалось добиться деления клеток и изменения их специализированного статуса. В настоящее время легко объяснить причины неудач Г. Габерландта. Основная из них заключается в выборе материала для исследований: высоко дифференцированные клетки, меристематическая активность которых минимальна, очень сложно заставить делиться, даже используя современные сложные питательные среды, обогащенные регуляторами роста в оптимальных концентрациях. Многие из растений, использованных Г. Габерландтом, относятся к однодольным, которые являются более сложными объектами для культуры клеток по сравнению с двудольными.

Неудачные попытки Г. Габерландта культивировать изолированные клетки растений заставили его последователей обратить внимание на более простые модели - культивирование изолированных органов. Э. Ханнигу (E. Hannig, 1904), культивируя на растворе солей и сахарозы незрелые зародыши редьки Raphanus sativus, Raphanus landra, Raphanus caudatus,хрена Cochlearia donica, удалось дорастить их до зрелого состояния. Позднее Ф. Лэйбах (F. Laibach, 1925, 1929) продемонстрировал большое практическое значение культуры in vitro зиготических зародышей для отдаленной гибридизации растений. Он вычленял и доводил до зрелости на питательной среде нежизнеспособные зародыши семян гибридов между льном многолетним Linum perenne и льном австрийским Linum austriacum, благодаря чему получил межвидовые гибриды, которые не удавалось получить обычными методами. В настоящее время метод эмбриокультуры нашел широкое применение в селекции для преодоления постгамной несовместимости (чаще всего связанной с нарушением развития эндосперма) при гибридизации различных видов растений.

В. Коттэ (W. Kotte, 1922) и В. Роббинс (W. Robbins, 1922) постулировали, что длительную культуру клеток растений можно получить из эксплантатов, содержащих меристематические клетки, например, кончиков корня или стебля. Так, В. Коттэ культивировал в течение двух недель кончики корня гороха и кукурузы на различных питательных средах, содержащих раствор солей Кнопа, глюкозу и некоторые азотные соединения (дрожжевой экстракт, аминокислоты аспарагин, аланин). В. Роббинс поддерживал в культуре кончики корня кукурузы более длительное время благодаря своевременной их пересадке на свежую питательную среду (этот прием получил название субкультивирование).

Значительный вклад в совершенствование метода культуры изолированных корней внес Ф. Уайт (P. White, 1934, 1937). Он модифицировал состав минеральных солей, в качестве источника углеводов использовал сахарозу, а вместо дрожжевого экстракта предложил смесь трех витаминов: тиамина, пиридоксина и никотиновой кислоты. Питательная среда Уайта со временем стала одной из основных в исследованиях по культуре клеток растений, она используется до настоящего времени.

Ф. Уайт

Этапное значение для развития методов культуры клеток растений имели результаты исследований Р. Готрэ (R. Gautheret, 1934), Ф. Уайта (P. White, 1939) и П. Нобекура (P. Nobecourt, 1939). Р. Готрэ получил каллюс (специфические наросты, состоящие из недифференцированных активно делящихся клеток, которые образуются у растений в естественных условиях в местах поранения; появление каллюса способствует заживлению ран) при культивировании клеток камбия ряда древесных (клена Acer pseudoplatanus, вяза Ulmus campestre, акации Robinia pseudoacacia, ивы Salix capre) на агаризованной питательной среде Кнопа с глюкозой и гидрохлоридом цистеина. Р. Готрэ наблюдал пролиферацию каллюса в течение 6 месяцев, однако затем культуры погибали, очевидно, из-за истощения эндогенного запаса фитогормонов эксплантата (части растения, взятой для получения культуры in vitro). Заслуга Р. Готрэ состоит в том, что он первым стал использовать питательные среды, содержащие ауксины, необходимые для поддержания пролиферации каллюсных клеток.

Р. Готрэ

В 1935 г. появилась публикация Р. Сноу (R. Snow, 1935) о стимулирующем влиянии ауксина индолилуксусной кислоты (ИУК) на камбиальную активность. Основываясь на этих данных, Р. Готрэ установил, что добавка ИУК в питательную среду усиливает пролиферацию каллюсной культуры, делая возможным ее продолжительное субкультивирование. Ф. Уайт (1939) получил аналогичные результаты на культуре опухолевых тканей гибрида Nicotiana glauca × Nicotiana langsdorffii, а П. Нобекур (1939) добился продолжительного роста каллюсной культуры, полученной из сегментов корнеплода моркови. Таким образом, усилиями этих ученых было экспериментально подтверждено предсказание Г. Габерландта о возможности длительного культивирования изолированных клеток растений на питательных средах, что стало возможным благодаря открытию и использованию в исследованиях по культуре клеток растений фитогормонов ауксинов.

Для того чтобы подтвердить гипотезу Г. Габерландта о тотипотентности растительной клетки, необходимо было добиться органогенеза в культуре каллюсных клеток и регенерировать целое растение. Это стало возможным в результате открытия другой важной группы фитогормонов - цитокининов. Сотрудники отдела ботаники Висконсинского университета (США) Ф. Скуг и Ч. Цуи (F. Skoog, 1944; F. Skoog, C. Tsui, 1951) установили, что аденин может стимулировать клеточные деления и индуцировать образование почек в культуре тканей табака в присутствии ауксина, который обычно действует как ингибитор образования почек. Однако эффект аденина был крайне слабым. В 1951 г. в лаборатории Ф. Скуга начал свои исследования К. Миллер (С. Miller), которому удалось в ходе напряженного поиска выделить сначала из дрожжевого экстракта, а затем из препаратов ДНК спермы сельди активный фактор, стимулирующий образование почек в культуре in vitro сегментов стебля табака. В ходе дальнейшего его изучения в сотрудничестве с коллегами из отдела биохимии Висконсинского университета была установлена химическая формула фактора (6-фурфуриламинопурин) и осуществлен его химический синтез (C. Miller и др., 1955, 1956), который был назван кинетином. Это был первый синтетический фитогормон из класса цитокининов. Позднее в отделе биохимии были получены, а в отделе ботаники протестированы другие, еще более активные производные аденина. Один из них - 6-бензиладенин (6-бензиламинопупин) - получил чрезвычайно широкое распространение в исследованиях по культуре клеток растений. В 1961 г. Миллеру удалось выделить из зерен кукурузы (Zea mays) пуриновое производное, отличное от кинетина, обладающее цитокининовой активностью. Это был первый природный цитокинин, получивший название зеатин (D. Letham, C. Miller, 1965).

Ф. Скуг

Создатели кинетина (слева - К. Миллер; справа налево: Ф. Стронг, Ф. Скуг, Ф. Окумура, М. фон Сальца)

Имея в своем распоряжении более активный по сравнению с аденином кинетин, Ф. Скуг и К. Миллер (1957) продолжили изучение роли ауксинов и цитокининов и их взаимодействия в процессах морфогенеза в культуре клеток табака. Варьируя в широких пределах концентрации кинетина и ауксина, они установили, что в случае, когда их концентрации приблизительно одинаковы, имеет место интенсивный рост каллюса, повышение концентрации ауксина относительно кинетина приводит к формированию корней, а превышение концентрации кинетина над ауксином - закладке стеблевых почек, из которых можно восстановить целое растение. В результате была сформулирована концепция гормональной регуляции морфогенеза в культуре клеток in vitro. Важно отметить, что Ф. Скуг и К. Миллер были первыми, кому удалось с помощью направленных экспериментальных воздействий (варьирование концентрации фитогормонов в питательной среде) индуцировать процесс вторичной дифференцировки каллюсных клеток и регенерировать из них целые растения. В настоящее время использование различных экзогенных фитогормонов (не только ауксинов, цитокининов, их аналогов, но и абсцизовой и гибберелловой кислот, этилена, ингибиторов их синтеза), варьирование их концентрации в питательной среде является основным подходом для получения растений-регенерантов.

В 1952 г. в лаборатории Ф. Стюарда (F. Steward) в Корнельском университете (США) была получена суспензионная культура клеток растений путем диссоциации в жидкой питательной среде каллюсных культур (F. Steward и др., 1952). Суспензию клеток можно было культивировать длительное время, периодически пересевая ее на свежую питательную среду, благодаря сконструированному в этой лаборатории встряхивающему устройству. Л. Бергманн (L. Bergmann, 1960), высевая на поверхность агаризованной питательной среды суспензию клеток табака, содержащую до 90 % одиночных клеток, добился образования колоний из отдельных клеток, а И. Вазил и А. Хильдебрандт (I. Vasil, A. Hildebrandt, 1965) регенерировали растения из таких колоний. Изучение поведения клеток растений в суспензионной культуре дало возможность сделать важное открытие. Ф. Стюард (F. Steward и др., 1958), Й. Райнэрт (J. Reinert, 1959) обнаружили, что при определенных условиях в суспензии клеток образуются биполярные зародышеподобные структуры - эмбриоиды, из которых при дальнейшем культивировании можно регенерировать целые растения. Это явление получило название соматического эмбриогенеза. Позднее было показано, что соматический эмбриогенез можно индуцировать не только в суспензии клеток, но и в культуре клеток на агаризованных питательных средах. Для многих видов растений получение растений-регенерантов из культивируемых клеток путем соматического эмбриогенеза значительно проще, чем с помощью индукции стеблевого органогенеза.

Таким образом, к середине прошлого века были сформулированы принципы культуры клеток растений in vitro и разработаны методические основы получения и поддержания клеточных культур на агаризованных и жидких питательных средах, а также растений-регенерантов из культивируемых клеток. В частности, большое значение имело открытие и использование для регуляции клеточных делений и индукции процессов морфогенеза различных регуляторов роста. Были значительно усовершенствованы питательные среды: питательная среда, предложенная Т. Мурасиге и Ф. Скугом (T. Murashige, F. Skoog, 1962), обеспечивала усиление роста клеточных культур в 5-7 раз по сравнению со средой Кнопа, которую применяли в начале XX в. В связи с этим появилась возможность использовать методы культуры клеток растений не только для фундаментальных исследований в области биологии клетки, но и решения конкретных практических проблем.

Т. Мурасиге

Уже в 1950-е гг. транснациональная фармацевтическая компания Pfizer пыталась наладить промышленное производство вторичных метаболитов (метаболитов, характерных для отдельных видов растений) с помощью наращивания больших объемов культивируемых клеток растений. Однако тогда были еще слабо изучены фундаментальные основы процесса, отсутствовали специально созданные для этих целей селекционные линии.

Быстрый прогресс в области производства вторичных метаболитов начался только в 1970-е гг. В настоящее время с помощью культуры клеток производят шиконин, сапонины женьшеня, берберин и многие другие ценные для фармакопеи и парфюмерной промышленности соединения, производство которых из природного сырья связано с определенными сложностями и экономически невыгодно.

Потенциал использования методов культуры тканей in vitro для быстрого вегетативного размножения растений впервые оценил французский ученый Ж. Морель (G. Morel, 1963). Проводя культивирование апикальных меристем (верхушка стебля с двумя-тремя зачатками листьев) орхидей, он обнаружил образование многочисленных протокормов - сферических образований, у основания которых в ходе культивирования формировался корень, а сверху листовые примордии. Протокормы можно было отсаживать и регенерировать из них целые растения. Процесс образования новых протокормов проходил достаточно долго, в результате чего можно было получать в большом количестве вегетативные клоны ценных генотипов. Идея размножать in vitro была быстро реализована на многих видах растений. Значительный вклад в разработку метода клонального размножения in vitro большого количества видов растений внес Т. Мурасиге. Наиболее простым оказался способ активации пазушных почек путем удаления верхушки стебля или с помощью добавки в питательную среду цитокининов (снятие эффекта апикального доминирования).

Выяснилось, что культура апикальных меристем позволяет получать свободные от вирусов растения-регенеранты даже в том случае, когда в качестве источника эксплантатов использовалось инфицированное растение, причем результат был тем лучше, чем меньше был размер эксплантата. Ж. Морель и К. Мартэн (G. Morel, C. Martin, 1952, 1955) впервые получили с помощью культуры апикальных меристем свободные от вирусов растения георгинов (Dahlia) и картофеля. Позднее для повышения эффективности оздоровления стали использовать нагревание растений (термотерапия) и добавку в питательную среду противовирусных препаратов (хемотерапия). Технологии клонального размножения растений invitro (можно встретить термины: технология микроклонального размножения, клонального микроразмножения или просто микроразмножения) и культуры меристем получили очень широкое распространение. Сейчас невозможно представить без их использования масштабное производство качественного посадочного материала картофеля, многих декоративных и лесных культур. Их применяют также для сохранения генетических коллекций вегетативно размножаемых растений.

Большое фундаментальное и практическое значение имели результаты работ индийских ученых С. Гухи и С. Магешвари (S. Guha, S. Maheswari, 1964) по культуре in vitro генеративных органов растений. Им впервые удалось получить гаплоидные растения в культуре пыльников дурмана Datura innoxia. Это означало, что тотипотентностью обладают не только соматические клетки растений, но и микроспоры, которые при определенных условиях способны менять программу развития с гаметофитной (образование зрелого пыльцевого зерна) на спорофитную. Процесс образования гаплоидов в культуре пыльников или микроспор получил название андрогенез in vitro. Гаплоиды можно получать не только из микроспор, но и из женских половых клеток при культивировании неоплодотворенных семяпочек (гиногенез in vitro), а также путем индукции развития in vivo неоплодотворенных яйцеклеток чужеродной пыльцой (для этого используют специально отобранные формы - так называемые гаплопродюсеры). Технологии получения гаплоидов и удвоенных гаплоидов нашли широкое применение в селекции растений для ускорения селекционного процесса и повышения его эффективности.

Уже в пионерских работах Р. Готрэ (R. Gautheret, 1955) и П. Нобекура (P. Nobecourt, 1955) была отмечена цитологическая нестабильность клеток при их длительном культивировании invitro. Среди полученных растений-регенерантов также оказалось достаточно много измененных форм, в том числе с различными нарушениями хромосомного состава (T. Murashige, R. Nakano, 1966; Р. Бутенко и др., 1967). Это привело к мысли, что прохождение клетками стадии неорганизованного роста в условиях in vitro может сопровождаться существенными изменениями их генотипа, проявляющимися на уровне целых растений, регенерированных из таких измененных клеток. Явление изменчивости клеточных линий и растений-регенерантов получило название сомаклональная вариабельность.

Выяснилось, что сомаклональную вариабельность можно значительно усилить с помощью мутагенных воздействий. Более того, добавляя в питательную среду определенные вещества (гербициды, соль, антибиотики и др.) или помещая культуры в условия повышенной или пониженной температуры, можно отбирать клеточные клоны, а затем и растения-регенеранты, устойчивые или толерантные к действию названных селективных факторов. Таким образом, появилась возможность использовать применительно к растениям методы селекции микроорганизмов путем отбора на клеточном уровне генотипов с определенными свойствами. Данная технология получила название клеточной селекции. Первыми ее применили Г. Мельхерс и Л. Бергманн (G. Melchers, L. Bergmann, 1959) для получения клеточных культур львиного зева Antirrhinum majus, устойчивых к повышенным температурам. П. Малига и другие (1973, 1975) вывели посредством клеточной селекции устойчивые к стрептомицину растения табака и изучили характер наследования мутантного признака в половых поколениях. С помощью отбора сомаклональных вариантов и технологии клеточной селекции получен ряд интересных мутантных форм и новых сортов. Эта технология нашла применение в генетической инженерии растений для первичного отбора трансформированных клеток (клеток, в геном которых произошла вставка нового генетического материала). Отдельные гены, выделенные из генома мутантных форм, полученных с помощью клеточной селекции, были использованы для получения трансгенных растений, в частности толерантных к гербицидам.

Еще одно важное достижение в области культуры клеток растений - разработка методов получения, культивирования и слияния протопластов - клеток, освобожденных от целлюлозно-пектиновой оболочки. В 1960 г. в лаборатории Э. Кокинга (E. Cocking) в Ноттингемском университете (Англия) была разработана методика получения большого количества протопластов из растительных тканей путем обработки их смесью пектолитических и целлюлитических ферментов, выделенных из культуральной жидкости грибов (E. Cocking, 1960). В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют клеточную оболочку и превращаются в обычные клетки. После того как они начинают делиться, образуется колония каллюсных клеток, из которых можно регенерировать целое растение.

Э. Кокинг

Однако для того чтобы происходили перечисленные события, необходимо использовать специальные питательные среды и условия содержания культур. Понадобилось более десяти лет для разработки методов культивирования протопластов и получения из них растений-регенерантов (T. Nagata, I. Takebe, 1971; G. Melchers и др., 1971; J. Nitch, K. Ohyama, 1971).

Это открыло перспективы использования протопластов в целях осуществления различных генетических манипуляций, недоступных для работ с обычными растительными клетками. В частности, большое значение имела разработка технологии соматической гибридизации (встречаются также термины парасексуальная гибридизация, неполовая гибридизация) путем слияния протопластов для преодоления межвидовых репродуктивных барьеров для вовлечения в селекцию ценного генофонда диких видов. Символично, что впервые слияния протопластов добились в лаборатории Э. Кокинга (J. Power и др., 1970). Однако первые растения соматических гибридов между разными видами табака (Nicotiana glauca + N. langsdorffii) были получены в США П. Карлсоном (P. Carlson и др., 1972). В настоящее время технология соматической гибридизации отработана для многих хозяйственно важных видов растений. Получено большое количество ценных соматических гибридов, на основе которых выведены новые сорта.

Значительный прогресс в этой области был достигнут в результате разработки технологии слияния протопластов под действием электрического тока (U. Zimmermann, P. Scheurich, 1981). Хотя следует заметить, что более ранние методы слияния протопластов с помощью специфических питательных сред (высокая рН, высокая концентрация ионов Ca²⁺) и добавки в среду некоторых веществ (так называемых фьюзогенов: полиэтиленгликоля, диметилсульфоксида и др.) не утратили актуальности до настоящего времени, так как они не связаны с использованием дорогостоящего электрооборудования.

Методы культуры протопластов нашли широкое применение в генетической инженерии растений, поскольку протопласты являются более доступным объектом для введения чужеродной генетической информации по сравнению с клетками растений, заключенными в целлюлозную оболочку.

В 1972 г. появились первые публикации сотрудников лаборатории П. Берга (P. Berg, США), в которых сообщалось о получении кольцевой молекулы ДНК вируса SV40 путем последовательного ее разрезания рестриктазой RI и сшивания ДНК лигазой (J. Mertz, R. Davis, 1972), а также возможности с помощью этих ферментов встраивать в такую молекулу гены других организмов: фага-λ и галактозный оперон (набор генов, ответственных за расщепление молочного сахара лактозы) бактерии Е. coli (P. Jackson, D. Symons, P. Berg, 1972). Эта методика получила название «технология рекомбинантных ДНК». Она наряду с технологией клонирования генов, предложенной Х. Бойером (Н. Boyer) и С. Коэном (S. Cohen и др., 1973), является ключевой в современной биотехнологии (генетической инженерии), имеющей целью конструирование новых комбинаций генетического материала и перенос их в геном живых организмов для улучшения свойств.

П. Берг

Первоначально методы генетической инженерии разрабатывались применительно к микроорганизмам. Однако благодаря тому, что к моменту зарождения новой биотехнологии были разработаны методы культуры клеток растений и регенерации из них целых растений, генетическая инженерия растений развивалась столь же стремительно, как и генетическая инженерия микроорганизмов. Без отработанных методов культуры каллюсных клеток и получения растений-регенерантов получение трансгенных растений было бы просто невозможно, поскольку трансформировать (встроить в геном дополнительные гены с соответствующими регуляторными элементами) можно лишь отдельные клетки, а не многоклеточный организм. Как отмечалось выше, весьма полезными оказались методы клеточной селекции (для отбора трансформированных клеток на селективных средах), культуры протопластов (для введения чужеродной ДНК).

Наиболее важными событиями в развитии генетической инженерии растений были разработки, касающиеся методов переноса и встраивания в геном растительных клеток, созданных in vitro генетических конструкций. Революционное значение имели прежде всего результаты исследования механизма агробактериальной трансформации. Уже в начале XX в. было установлено, что болезнь растений, известную под названием «корончатый галл», вызывает почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens. Клетки корончатого галла в культуре invitro вели себя весьма своеобразно: для их пролиферации не требовалось добавление в питательную среду регуляторов роста, они их синтезировали самостоятельно.

В 1974 г. бельгийские ученые Н. ван Ларебеке и И. Зэенен (N. van Larebeke и др.; I. Zaenen и др.) установили, что у вирулентных штаммов A. tumefaciens имеется большая плазмида, названная Тi-плазмидой (от англ. tumor inducing - вызывающая опухоль), которая отсутствует у штаммов, не способных вызывать заболевание. В 1977 г. М.-Д. Чилтон получила доказательство того, что опухоль возникает в результате включения в геном растительной клетки определенного фрагмента Тi-плазмиды (Т-ДНК). Причем гены, расположенные на Т-фрагменте ДНК бактериальной плазмиды, активно экспрессируются в растительной клетке, что выражается в синтезе большого количества специфических соединений опинов. Помимо опинов в клетках образуются в повышенных концентрациях ауксины и цитокинины, что приводит к образованию опухоли и является причиной гормон-независимости в культуре клеток in vitro. Это означало, что в природе существует механизм горизонтального (т. е. между отдаленными в систематическом отношении видами живых организмов) переноса генетической информации: от бактерий к растениям. Быстро выяснилось, что этот механизм можно успешно использовать в генетической инженерии, замещая на нужные гены большую часть Т-ДНК (кроме небольших участков в 25 пар нуклеотидов по ее концам), на которой расположены гены патогенности. Уже в 1984 г. с помощью агробактериальной трансформации были получены первые трансгенные растения табака с бактериальными генами устойчивости к антибиотикам (M. De Block и др., 1984; R. Horsch и др., 1984). А через два года были получены устойчивые к вирусу табачной мозаики (TMV) трансгенные растения табака с геном белка оболочки вируса, которые могли представлять практический интерес (P. Powell-Abel и др., 1986).

М.-Д. Чилтон

С помощью агробактерий можно было трансформировать в основном только двудольные растения. Поэтому для получения трансгенных форм однодольных растений требовался более универсальный метод. В 1987 г. был предложен метод прямого переноса генов в растительные клетки, получивший название метод биологической баллистики (биолистики), или, как его еще называют, бомбардировки частицами (англ.: particle bombardment), генного дробовика (англ.: gene gun technique) (J. Sanford и др., 1987; T. Klein и др., 1987). Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частицы (диаметром 0,4-1,7 мкм) из вольфрама или золота напыляют рекомбинантные ДНК, содержащие предназначенные для переноса гены с необходимыми регуляторными элементами. Эти частицы разгоняют до огромной скорости (300600 м/сек) в специальном пневматическом аппарате (генной пушке) и помещают на их пути растительные ткани (меристемы, незрелые зародыши, колеоптили, протокормы, пыльцу) или культуры клеток (каллюс или суспензию клеток). В результате частицы проникают в клетки, а чужеродная ДНК встраивается в ДНК хромосом или органелл. Несмотря на ряд недостатков (нежелательная для трансформации растений многокопийность вставок, разрушение части вносимых генных конструкций и др.), метод биолистики - основной для получения трансгенных однодольных растений, среди которых все злаковые культуры, а также двудольных растений, некомпетентных или слабо компетентных для агробактериальной трансформации.

В 1994 г. в США было выдано первое разрешение на использование в качестве продуктов питания и для производства кормов трансгенных форм сои (Round Up Ready фирмы Monsanto), толерантной к гербициду глифосату, и томатов (FLAVR SAVR фирмы Calgene) с удлиненным сроком хранения плодов. С этого момента началась эра производственного выращивания генетически модифицированных сельскохозяйственных культур. В 1996 г. Под ГМО было занято 1,7 млн га. В 2013 г. были допущены к использованию трансгенные формы 20 сельскохозяйственных культур с такими признаками, как толерантность к разным гербицидам, устойчивость к насекомым, вирусам, с улучшенными качественными характеристиками, которые выращивали в 27 странах на 175,2 млн га, т. е. менее чем за двадцать лет площади под генноинженерными сортами увеличились более чем в 100 раз.

В Советском Союзе в 1960-е гг. методы культуры клеток первыми начали использовать в своих исследованиях ученые Института физиологии растений АН СССР им. К. Тимирязева. Большой вклад в популяризацию в стране перспективной технологии и подготовку специалистов в этой области внесла Р. Г. Бутенко. По ее инициативе начиная с 1968 г. каждые четыре года проводится международная конференция, на которой рассматриваются разные направления биотехнологии растений. Во многом благодаря ее помощи сложились научные центры и лаборатории по биотехнологии растений в Санкт-Петербурге, Саратове, Новосибирске, Уфе, Киеве, Одессе, Минске.

Р. Г. Бутенко

В Беларуси развитие клеточных и генно-инженерных технологий начали в Институте генетики и цитологии АН БССР под руководством Н. А. Картеля и Л. В. Хотылевой, в Институте экспериментальной ботаники АН Беларуси под руководством А. С. Вечера и В. Н. Решетникова.

Заключение

Г. Габерландт в 1902 г. предложил концепцию культуры клеток растений in vitro, согласно которой клетки растений можно культивировать в условиях асептики длительное время на питательной среде, содержащей раствор минеральных солей и органические добавки. Габерландт также выдвинул гипотезу о тотипотентности растительной клетки, в соответствии с которой из культивируемых клеток можно регенерировать отдельные органы и даже целое растение. Понадобилось значительное количество времени, чтобы доказать правомерность идей Габерландта на практике. Это стало возможным благодаря совершенствованию питательных сред и условий культивирования клеток. Ключевое значение имело установление роли ауксинов (R. Gautheret, 1934; F. White, 1939; P. Nobecourt, 1939) и цитокининов (C. Miller и др., 1955, 1956; F. Skoog, C. Miller, 1957) в регуляции процессов роста и морфогенеза в культуре клеток растений.

В 1952 г. в Корнельском университете (США) была получена суспензионная культура клеток растений путем диссоциации в жидкой питательной среде каллюсных культур (F. Steward и др., 1952). Изучение поведения клеток растений в суспензионной культуре дало возможность обнаружить явление соматического эмбриогенеза - образование при определенных условиях биполярных зародышеподобных структур - эмбриоидов, из которых при дальнейшем культивировании можно регенерировать целые растения.

К середине прошлого века были сформулированы принципы культуры клеток растений in vitro и разработаны методические основы получения и поддержания клеточных культур на агаризованных и жидких питательных средах, получения растений-регенерантов из культивируемых клеток путем индукции стеблевого органогенеза или соматического эмбриогенеза. В связи с этим появилась возможность использовать методы культуры клеток растений не только для фундаментальных исследований в области биологии клетки, но и решения конкретных практических проблем. Было налажено производство с помощью культуры клеток растений ценных для фармакопеи и парфюмерной промышленности соединений, выделение которых из природного сырья связано с определенными сложностями и экономически невыгодно. Сложилась мощная индустрия производства высококачественного посадочного материала картофеля, декоративных, плодовых и лесных культур, основанного на методах культуры меристем и клонального размножения растений in vitro. Технологии получения гаплоидов и удвоенных гаплоидов, начало разработке которых положено исследованиями С. Гухи и С. Магешвари (S. Guha, S. Maheswari, 1964), нашли широкое применение в селекции растений для ускорения и повышения эффективности селекционного процесса. Разработка методов выделения, культивирования и слияния протопластов (E. Cocking, 1960; T. Nagata, I. Takebe, 1971; J. Power и др., 1970; P. Carlson и др., 1972, U. Zimmermann, P. Scheurich, 1981) дала возможность получать межвидовые гибриды с участием диких сородичей культурных видов, ранее недоступных для селекции из-за жестких репродуктивных барьеров. В результате были интрогрессированы в селекционный материал новые ценные гены устойчивости к болезням и вредителям, неблагоприятным факторам внешней среды. Открытие явления сомаклональной изменчивости (T. Murashige, R. Nakano, 1966; Р. Г. Бутенко и др., 1967) и разработка методов клеточной селекции (G. Melchers, L. Bergmann, 1959; P. Maliga и др., 1973, 1975) способствовали повышению эффективности селекции растений, основанной на отборе мутантных форм.

Благодаря тому, что к моменту зарождения генетической инженерии были разработаны методы культуры клеток и регенерации из них целых растений, быстрое развитие получила генетическая инженерия растений. Применение методов культуры клеток растений в сочетании со специальными методами генетической инженерии: технологией рекомбинантных ДНК (P. Jackson, D. Symons, P. Berg, 1972), клонирования генов (S. Cohen и др., 1973), агробактериальной трансформации (M.-D. Chilton и др., 1977), биолистики (J. Sanford и др., 1987; T. Klein и др., 1987) - сделало возможным использование в селекции растений всего многообразия ценных генов, существующих в природе. С 1994 г. началась эра производственного выращивания генетически модифицированных сельскохозяйственных культур.

Контрольные вопросы

1. В чем суть концепции культуры клеток растений in vitro Г. Габерландта?

2. Какие ученые установили значение ауксина в стимуляции роста клеточных культур растений?

3. Когда у ученых появилась возможность индуцировать процессы морфогенеза в культуре недифференцированных клеток растений и получать растения- регенеранты?

4. При каких обстоятельствах было открыто явление соматического эмбриогенеза?

5. Когда и кем была разработана питательная среда, которая в настоящее время наиболее широко используется в исследованиях по культуре клеток растений?

6. Кто первым получил гаплоиды, используя культуру пыльников?

7. Кто и когда предложил методику ферментативного гидролиза клеточных оболочек для получения протопластов растений?

8. Когда было получено первое трансгенное растение?