БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Генна інженерія тварин. Технологія одержання трансгенних тварин

У 1973 р. з’явився термін «трансгенез», що означав перенесення генів з одного організму до іншого, у тому числі еволюційно віддаленого. Трансгенез дозволяє покращувати генотип існуючих порід домашньої худоби і виводиш породи з новими ознаками. Актуальним є створення домашніх тварин зі спадковою стійкістю до бактеріальних і вірусних інфекцій, паразитарних інвазій.

Рудольф Яниш вивів перші трансі енні тварини у 1974 р. у Кембриджі (США) у результаті ін’єкції в ембріон миші ДНК вірусу мавпи S V 40.

У 1980 р. американський учений Гордон для створення трансгенних тварин запропонував використовувати мікроін’єкцію ДНК у пронуклеус зиготи. Цим підходом започатковано поширення технології створення трансгенних тварин. У 1985 р. у СШЛ за допомогою мікроін’єкцій ДНК у пронуклеус зиготи одержано перші трансгенні сільськогосподарські тварини: кролі, вівці, свині, У Росії перші трансгенні тварини з’явилися у 1982 р.

На сію годні, крім методу мікроін’єкцій, застосовуються інші методи одержання трансгенних тварин: інфікування клітин рекомбінантними вірусами, електропорація, бомбардування клітин золотими або вольфрамовими частинками з нанесеними на їх поверхню рекомбінантними ДНК.

Генетична модифікація тварин за допомогою технології рекомбінантної ДНК ґрунтується на введенні клонованого гена в геном клітини, з якої могли б утворитися клітини зародкової лінії. За рахунок схрещення трансгенних нащадків можна одержувати гомозиготні лінії трансі енних тварин.

Технологія одержання трансгенних тварин включає такі етапи:

- уведення клонованого гена в ядро заплідненої яйцеклітини;

- імплантація яйцеклітини в матку реципієнтної тварини;

- відбір потомства, що містить клонований ген у всіх клітинах;

- схрещення тварин, що несуть клонований ген, й одержання нової генетичної лінії.

Альтернативний підхід полягає у виділенні ембріональних стовбурових клітин і трансфекції їх клонованим геном. Клітини, що містять ген-мішень, відбирають і культивують, а потім уводять в ембріони на ранніх стадіях розвитку. Ембріональні стовбурові клітини можуть дати початок клітинам будь-якого типу, у тому числі клітинам зародкової лінії. Для трансформації ембріональних стовбурових клітин використовують штучні хромосоми на основі дріжджів. Таким способом були одержані миші, що синтезують людські антитіла.

На моделі трансгенних лабораторних тварин досліджуються функції різних генів, регуляція їх експресії, фенотипний прояв генів, мутагенез тощо. Трансгенних тварин з пошкодженням певного ієна можна використовувати як модель для вивчення захворювань людини на молекулярному рівні. Наприклад, «нокаут» (спрямоване пошкодження) гена родопсину у мишах інактивує палички сітківки, що імітує захворювання людини - пігментний ретиніт. За допомогою таких тварин можна вивчати процес дегенерації сітківки, а також терапевтичний ефект лікарських препаратів. Створено понад 250 ліній мишей з «нокаутованими» генами, що використовуються як моделі для вивчення різних захворювань людини.

Деякі трансгенні тварини (корови, вівці і кози) можуть використовуватися як своєрідні «біологічні фабрики» для одержання продуктів клонованих генів, що секретуються в молоко. В 1 л молока таких тварин міститься від десятків міліграмів до кількох грамів біологічно активних білків людини. З молоком трансгенних тварин можна отримувати лікарські препарати, а також ферменти. Наприклад, трансгенні кози є продуцентами а_гантитрипсину, антитромбіну III. У Росії створено трансгенні вівці, що синтезують ферменти хімозин і ренін. Вміст хімозину в молоці трансгенних тварин становить 300 мг/л. Хімозин і ренін використовуються для виготовлення сиру. Від 20 трансгенних корів за 1 рік можна одержати приблизно 100 кг рекомбінантного білка С, який застосовують для профілактики тромбоутворення. Однієї трансгенної корови достатньо, щоб задовольнити щорічну потребу у факторі згортання крові IX, який уводять хворим на гемофілію. Але створення трансгенних корів потребує багато часу: щоб виростити статевозрілу тварину із заплідненої яйцеклітини, необхідно приблизно 2 роки.

Етапи одержання трансгенних корів:

- збір ооцитів;

- дозрівання ооцитів in vitro;

- запліднення ооцитів in vitro;

- центрифугування запліднених яйцеклітин (для візуалізації чоловічого пронуклеуса, концентрування жовтка);

- мікроін’єкція ДНК у чоловічий пронуклеус;

- розвиток ембріонів in vitro до стадії бластоцисти;

- імплантація ембріонів реципієнтним самкам;

- скринінг ДНК нащадків на наявність транс гена.

У тестових експериментах із 2470 ооцитів було одержано двоє трансгенних телят. Це свідчить про низьку ефективність методу. На сьогодні триває вдосконалення методики трансгенезу.

Сучасні методи перенесення генів недостатньо ефективні: для одержання однієї трансгенної тварини необхідно здійснити мікроін’єкції ДНК у 40 зигот миші, 90 зигот кози, 100 зигот свині, ПО зигот вівці, 1600 зигот корови. Із 1000 імплантованих запліднених яйцеклітин розвивається від 30 до 50 трансгенних тварин. Механізми інтеграції екзогенної ДНК і формування автономних репліконів під час трансгенезу невідомі. Вбудовування трансгенів у кожної трансгенної тварини здійснюється у різні ділянки хромосом, причому може відбуватися вбудовування однієї або кількох копій трансгена.