БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 3. КЛІТИННА ІНЖЕНЕРІЯ

Культивування клітин. Клітинні лінії

Однією з основних властивостей культури клітин є обмежена тривалість життя. Після 50 — 100 поділів клітини культури гинуть. Чим молодший вік організму, з якого одержані клітини для культивування в культурі, тим більшу кількість разів вони здатні ділитися, перш ніж загинуть. Наприклад, клітини плода здатні ділитися в культурі 50 разів, клітини новонародженого - 30 разів. Іноді в культурі виявляються мутантні клітини, які можуть ділитися необмежену кількість разів. Такі клітини можуть утворити клітинну лінію.

Клітинна лінія - це клітини, які можна культивувати поза організмом протягом невизначено тривалого часу. Багато з клітинних ліній походять з пухлин. З 1951 р. культивується в культурі лінія анеуплоїдних (60 - 70 хромосом) пухлинних клітин, відомих під назвою Неlа. Ці клітини одержано з пухлинної тканини матки померлої від раку негритянки Ганрісти Лак (США). Тепер ця клітинна лінія в умовах лабораторій за показниками росту перевершує інші клітинні лінії, добуті пізніше від хворих на рак людей білої раси. Найпоширеніші клітинні лінії наведено в табл. 3.1.

Таблиця 3.1

Найпоширеніші клітинні лінії

Клітинна лінія	Тип клітин і організм, з якого добуто клітинну лінію
ЗТЗ	Фібробласт миші
ВНК 21	Фібробласт сірійською хом’ячка
Неlа	Епітеліальна клітина людини
L 6	Міобласт пацюка
PC 12	Хромафінова клітина пацюка
SP 2	Нлазмагична клітина миші
РTК 1	Епітеліальна клітина пацюка кенгурового

Більшість клітинних ліній культивують на твердій поверхні, хоча деякі (ВНК 21, Hela, SP 2) можуть рости в суспензії. Клітини, які прикріплені до субстрату, здебільшого ущільнені і мають витягнуту веретеноподібну форму. Клітини, що ростуть у суспензії, як правило, мають сферичну форму.

Для культивування клітин використовують пластикові або скляні ємності, поверхня яких підготовлена для прикріплювання клітин. З метою забезпечення стерильності використовують стерильний посуд разового використання. Після висівання на поживне середовище культури клітин культивують за температури 37°С, pH = 6,8 — 7,5 у середовищі, що містить 5% СО₂ і 95% повітря. Зміна pH на 0,2 — 0,4 призводить до загибелі клітин.

Для підтримання функціонально активного стану культури клітин застосовують стандартні поживні середовища, основними компонентами яких є мінеральні солі, амінокислоти, вітаміни, антибіотики.

Таблиця 3.2

Склад середовища Ігла

Компонентсередовища	Концентрація		Компонентсередовища	Концентрація
Компонентсередовища	мг/л	ммоль/л	Компонентсередовища	мг/л	ммоль/л
Солі (збалансований сольовий розчин Ерла)
NaCl	6800	10,0	MgSО₄·7H₂О	200	0,5
КСl	400	5,0	NaH₂PО₄·2H₂О	150	1,0
СаСІ₂	200	1,0	NaHCО₃	2000	20,0
Амінокислоти
Аргілін НСІ	21	0,1	Метіонін	7,5	0,05
Гліцин	292	2,0	Фенілаланін	18	0,1
Цистеїн	12	0,05	Триптофан	4	0,02
Ґістидин-НСІ	9,5	0,05	Тирозин	18	0,1
Ізолейцин	26	0,2	Треонін	24	0,2
Лізин-НСІ	36	0,2	Валін	24	0,2
Вітаміни
Біотин	1	10^-3	Нікотинамід	1	10^-3
Холінхлорид	1	10^-3	Пантотенат кальцію	1	10^-3
Фолієва кислота	1	10^-3	Рибофлавін	0,1	10^-4
Інозит	2	2· 10^-3	Тіамін	1	10^-3
Добавки
Компонент	Концентрація (%)		Компонент	Концентрація (%)
Стрептоміцин	0,005		Пеніцилін	0,005
Феноловий червоний	0,0005		Сироватка (діалізована)	5
Глюкоза	5

У 1955 р. Г. Ігл для культивування клітин запропонував використовувати багатокомпонентну суміш, відому як середовище Ігла (табл. 3.2). Відомі модифікації складу поживного середовища Ігла, запропоновані іншими дослідниками.

Для стимулювання клітинного поділу у середовище культивування додають мітогени. Серед мітогенів розрізняють групу речовин, відомих під назвою фактори росту. Ці речовини є білками, вони мають властивості, подібні до гормонів. Ідентифіковані фактори росту нервів (ФРН), епідермісу (ФРЕ), фібробластів (ФРФ). Мітогенну дію мають також лектиші. Основним джерелом лектинів є бобові, що містять 1,5—3% лектинів від загальної кількості білків.

Клітинну масу для культивування отримують, обробляючи відповідну тканину протеолітичними ферментами (трипсин, колагеназа) і сполуками, які зв’язують іони Са²⁺ (ЕДТА). Потім тканину піддають м’якому механічному руйнуванню. Для ізолювання окремих клітин суспензію фракціонують. Більші клітини від менших відділяють методом седиментації або центрифугування. Розроблено сучасні методи ідентифікації клітин, що мають дуже високу продуктивність - 5 тис. клітин за 1 секунду. Виділені клітини переносять на поживне середовище для культивування. Поодинокі еукаріотичні клітини швидко гинуть. З урахуванням цього відібрані для культивування клітини накосять на шар клітин, які після опромінення втратили здатність до поділу, але ще на певний час зберегли метаболізм.

Для зберігання культури клітин використовують рідкий азот. Щоб запобігти пошкодженню клітин під час заморожування, до культури додають гліцерол. Перевагою клітинних ліній є те, що після розморожування вони зберігають здатність до розмноження протягом тривалого часу.