БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 3. КЛІТИННА ІНЖЕНЕРІЯ

Мікроклональне розмноження рослин

Мікроклональне розмноження є новим методом вегетативного розмноження рослин. Цей метод дозволяє з окремих клітин одержати цілу рослину. Мікроклональне розмноження — одержання in vitro нестатевим шляхом рослин, генетично ідентичних вихідному екземпляру.

Термін «клон» був запропонований у 1903 р. Уебстером (з гр. klon — «пагін, придатний для розмноження рослин»).

Піонером мікроклонального розмноження є французький учений Жан Морель — у 50-х роках XX ст. він одержав перші рослини - регенеранти орхідей. У СРСР під керівництвом Р.Г. Бутенко були вивчені умови мікророзмноження картоплі, цукрового буряка, гвоздики, гербери. Перші праці з культури тканин деревних рослин опубліковано в середині 20-х років XX ст. У цей час Готре встановив, що камбіальні тканини деяких рослин здатні до утворення каллуса in vitro. У 60-х роках XX ст. Матес одержав перші рослини-регенеранти осики, доведені до фунтової культури. Понад 200 видів деревних рослин із 40 родин були розмножені in vitro.

Ефективність мікроклонального розмноження рослин залежить від фізіологічних особливостей рослин та умов їх культивування: температура (18 — 26°С), освітлення, вологість повітря (65 — 70%). Вихідні материнські рослини повинні бути здорові (не пошкоджені грибами, вірусами, бактеріями) і перебувати у стані інтенсивного росту. Як експлант краще використовувати молоді, малодиференціновані тканини, що містять меристему (молоді листки, бруньки). Ексгіланти попередньо обробляють фунгіцидами й антибіотиками проти грибної і бактеріальної інфекції.

Етапи мікроклонального розмноження:

- відбір рослини-донора, ізолювання експлантів й одержання стерильної культури клітин;

- власне мікророзмноження - одержання максимальної кількості меристемних клонів;

- укорінення розмножених пагонів з подальшою їх адаптацією до умов фунту;

- вирощування рослин в умовах теплиці і підготовка їх до висадки у відкритий фунт.

Для культивування тканин на кожному етапі застосовують поживне середовище певного складу. Склад поживного середовища добирають для кожного виду рослин. На першому етапі до складу поживного середовища вводять антибіотики в концентрації 100 — 200 мг/л для одержання стерильної культури, а також стимулятори рослу (ауксини, цитокініни), антиоксиданти (аскорбінова кислота — 1 мг/л, глутатіон -4 — 5 мг/л) та інші біологічно активні речовини. Тривалість першого етапу становить 1-2 місяці.

На другому етапі основну роль під час вибору оптимальних умов культивування експлантів відіграє співвідношення в поживному середовищі цитокінінів та ауксинів.

На третьому етапі у складі поживного середовища зменшують у 2 - 4 рази концентрацію мінеральних солей, знижують вміст вуглеводів до 0,5— 10 %, виключають цитокініни, залишають ауксини. Як відомо, ауксини стимулюють формування коренів.

На четвертому етапі рослини вирощують у теплиці, готуючи до висаджування у фунт. Найсприятливіший час для пересадки рослин- регенерантів у субстрат — весна і початок літа (висаджують рослини із 2 — 3 листками і сформованою кореневою системою). Як субстрат використовують торф, пісок (3:1), дерновий фунт, перліт. Субстрат стерилізують за температури 85 — 90 С протягом 1 — 2 год. Через 20 — 30 днів після висаджування у фунт рослини підживлюють мінеральними добривами. Процес адаптації рослин до умов фунту є найдорожчою і найбільш трудоємною операцією.

Порівняно з традиційними способами розмноження метод мікроклонального розмноження має такі переваги:

- одержання генетично однорідного матеріалу;

- оздоровлення рослин, звільнення їх від вірусів за рахунок використання меристемної культури;

- високий коефіцієнт розмноження: 10⁵- 10⁶-для трав’яних і квіткових рослин, 10⁴- 10⁵ - для кущів, 10⁴-для хвойних;

- скорочення тривалості селекційного процесу;

- прискорення переходу рослин від ювенільної до репродуктивної фази розвитку;

- розмноження рослин, які важко розмножуються вегетативно (деревні породи);

- можливість проведення робіт протягом року;

- тисячі рослин можуть рости на невеликій лабораторній площі (на 1 м² лабораторної площі можна за короткий термін виростити 100 тис. рослин-клонів);

- можливість автоматизації процесу вирощування.

Найбільш економічно вигідно розмножувати в культурі тканин селекційні сорти квітів: орхідей, агав, бегоній, хризантем, цикламенів, драцени, іриса, лілій, нарциса, флокса. За рік з однієї рослини гербери можна одержати до 1 млн рослин-клонів. Новою сферою застосування клонування у стерильному середовищі стало розмноження порід кущів, плодових культур, ананаса.