БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Виділення нуклеїнових кислот

Генно-інженерні роботи розпочинаються з одержання препаратів високоочищених нуклеїнових кислот. Сучасні методи виділення нуклеїнових кислот містять такі етапи:

1) руйнування клітин;

2) інактивація нуклеаз для запобігання розщепленню нуклеїнових кислот;

3) очистка виділених нуклеїнових кислот.

Зі зруйнованих клітин одержують хромосоми. Цей процес здійснюють автоматично в цитометрах. Сучасні методи дозволяють одержати за добу 7,5-10⁷ індивідуальних хромосом людини.

Під час виділення нуклеїнових кислот до складу буферних розчинів для руйнування клітин уводять інгібітори нуклеаз. Як інгібітори нуклеаз використовують неспецифічні денатуруючі агенти (іонні детергенти, гуанідинхлорид, фенол, хлороформ), а також специфічні інгібітори (ванадієві комплекси рибонуклеозидів або інгібітор РНКази із плаценти людини).

Для відокремлення домішок РИК від ДНК використовують високоочищені препарати ферментів РНКаз (найчастіше панкреатичну РНКазу), а під час виділення РНК - препарати ДНКаз. У процесі використання методів виділення ДНК із тканин тварин одночасно виділяється мітохондріальна та ядерна ДНК. Якщо необхідно виділити ядерну ДНК, спочатку одержують ядра клітин, якщо мітохондріальну — мітохондрії.

Для очищення ДНК від білків (депротеїнізації) застосовують протеолітичні ферменти (протеїназу К із Trirachium album або протеїназу із Streptomyces griseus), фенол, хлороформ.

Для додаткового очищення плазмідної ДНК іноді застосовують гель-фільтрацію або електрофорез в агарозному гелі. Для очищення еукаріотичної мРНК застосовують метод афінної хроматографії на оліго(dТ)- целюлозі.