Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Генная терапия
Заключение

Для многих наследственных заболеваний никаких достаточно эффективных способов лечения не существует, и во многом это связано с трудностями получения и адресной доставки соответствующего генного продукта. После разработки методов идентификации и клонирования нормальных вариантов дефектных генов (часто в виде кДНК) были предприняты попытки использовать их для коррекции генетических дефектов. Для лечения заболеваний на молекулярном уровне применяются два основных подхода: генная терапия ex vivo и генная терапия in vivo.

При генной терапии ex vivo «терапевтический» ген переносят в изолированные клетки больного с помощью ретровирусных векторов или других систем доставки, трансдуцированные клетки культивируют и вводят пациенту. При этом у реципиента не развивается нежелательного иммунного ответа, но сама процедура является весьма дорогостоящей и трудоемкой. Альтернативный способ генной терапии ех vivo использует генноинженерную модификацию неаутологичных клеток, заключенных в мембрану, которая предотвращает развитие нежелательного ответа и не препятствует высвобождению «терапевтического» генного продукта.

При генной терапии in vivo «терапевтический» ген вводят непосредственно в клетки ткани-мишени больного. Для этого разработаны разные системы доставки: вирусные (ретровирусные, аденовирусные, аденоассоциированные векторы и векторы на основе вируса простого герпеса) и невирусные (инъекция чистой ДНК, бомбардировка ткани-мишени частицами, конъюгированными с ДНК, захват клетками ДНК, заключенной в липидную оболочку). Кроме того, разработаны вирусные и невирусные системы доставки генов, специфичные для определенных клеток.

Весьма перспективным способом разрушения быстроделящихся раковых клеток представляется генная активация лекарственного вещества. При этом наиболее широко используется подход, включающий последовательное введение в опухолевые клетки гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk) и ганцикловира. В результате образуется ганцикловиртри-фосфат, токсичный для быстроделящихся клеток. Погибают и нетрансформированные клетки, контактирующие с HSVtk-модифицированными клетками («эффект свидетеля»).

В качестве лекарственных средств можно использовать не только генные продукты, но и олигонуклеотиды. С помощью так называемых «антисмысловых» олигонуклеотидов можно подавить полностью или частично экспрессию гена того или иного наследственного заболевания. В одном из вариантов такой терапии клонированный ген встраивают в экспрессирующий вектор в обратной ориентации, в результате чего образуется комплементарный нормальной мРНК ДНК-транскрипт, который спаривается с ней и ингибирует трансляцию. В более распространенном варианте введенный в клетку-мишень «антисмысловой» олигонуклеотид гибридизуется со специфической мРНК и блокирует ее трансляцию. Эффективность «антисмысловых» олигонуклеотидов и время их жизни повышаются в результате модификаций, затрагивающих фосфодиэфирную связь, пиримидины и остатки сахаров. В настоящее время изучается терапевтическое действие различных олигонуклеотидов: модифицированных с помощью генной инженерии рибозимов, расщепляющих специфические мРНК; аптамеров, которые связываются со специфическими белками и блокируют их функции; олигонуклеотидов, с помощью которых можно корректировать замену одной нуклеотидной пары и мутации, приводящие к неправильному сплайсингу.

ЛИТЕРАТУРА

Agrawal S. (ed.) 1996. Antisense Therapeutics. Humana Press Inc., Totowa, N. J.

Altman S. 1993. RNA enzyme-directed gene therapy. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 10898-10900. Anderson W. F. 1992. Human gene therapy. Science 256: 808-813.

Blaese R. M., K. W. Culver, A. D. Miller, C. S. Carter, T. Fleisher, M. Clerici, G. Shearer, L. Chang, Y. Chiang, P. Tolstoshev, J. J. Greenblatt, S. A. Rosenberg, H. Klein, M. Berger, C. A. Mullen, W. J. Ramsey, L. Muul, R. A. Morgan, W. F. Anderson. 1995. T lymphocyte-directed gene therapy for ADA^- SCID: initial trial results after 4 years. Science 270: 475—480.

Bordignon C., L. D. Notarangelo, N. Nobili, G. Ferrari, G. Casorati, P. Panina, E. Mazzolari, D. Maggioni, C. Rossi, P. Servida, A. G. Ugazio, F. Mavilio. 1995. Gene therapy in peripheral blood lymphocytes and bone marrow for ADA immunodeficient patients. Science 270: 470—475.

Breaker R. R. 1997. DNA enzymes. Nat. Biotechnol. 15: 427-431.

Burfeind P., C. L. Chemicky, F. Rininsland, J. Ilan, J. Ilan. 1996. Antisense RNA to the type I insulinlike growth factor receptor suppresses tumor growth and prevents invasion by rat prostate cancer cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7263-7268.

Caplen N. J., E. W. F. W. Alton, P. G. Middleton, J. R. Dorin, B. J. Stevenson, X. Gao, S. R. Durham, K. Jeffery, M. F. Hodson, C. Coutelle, L. Huang, D. J. Porteus, R. Williamson, D. M. Geddes. 1995. Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. Nat. Med. 1: 39-46.

Cole-Strauss A., K. Yoon, Y. Xiang, В. C. Bryne, M. C. Rice, J. Gryń, W. K. Holloman, E. B. Kmiec. 1996. Correction of the mutation responsible for sickle cell anemia by an RNA-DNA oligonucleotide. Science 273: 1386—1389.

Cometta K., R. A. Morgan, W. F. Anderson. 1991. Safety issues related to retroviral-mediated gene transfer in humans. Hum. Gene Ther. 2: 5—14. Crystal R. G. 1995. Transfer of genes to humans: early lessons and obstacles to success. Science 270: 404-410.

Culver К. W., F. W. Anderson, R. M. Blaese. 1991. Lymphocyte gene therapy. Hum. Gene Ther. 2: 107-109.

Culver K. W., Z. Ram, S. Wallbridge, H. Ishii, E. H. Oldfield, R. M. Blaese. 1992. In vivo transver with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science 256: 1550-1552.

Ellington A. D., R. Conrad. 1995. Aptamers as potential nucleic acid pharmaceuticals. Biotechnol. Annu. Rev. 1: 185—214.

Emerich D. F., S. R. Winn, P. M. Hantraye, M. Peschanski, E.-Y. Chen, Y. Chu, P. McDermott, E. E. Baetge, J. H. Kordower. 1997. Protective effect of encapsulated cells producing neurotrophic factor CNTF in a monkey model of Huntington’s disease. Nature 386: 395-399.

Fender P., R. W. H. Ruigrok, E. Gout, S. Buffet, J. Chroboczek. 1997. Adenovirus dodecahedron, a new vector for human gene transfer. Nat. Biotechnol. 15: 52—56.

Flotte T. R., B. J. Carter. 1995. Adeno-associated virus vectors for gene therapy. Gene Ther. 2: 357-362.

Grossman M., S. E. Raper, K. Kozarsky, E. A. Stein, J. F. Engelhardt, D. Muller, P. J. Lupien, J. M. Wilson. 1994. Successful ex vivo gene therapy directed to liver in a patient with familial hypercholesterolaemia. Nat. Genet. 6: 335-341.

Harrington J. J., G. V. Bokkelen, R. W. Mays, K. Gustashaw, H. F. Willard. 1997. Formation of de novo centromeres and construction of first- generation human artificial microchromosomes. Nat. Genet. 15: 345—355.

Ishii-Morita H., R. Agbaria, C. A. Mullen, H. Hirano, D. A. Koeplin, Z. Ram, E. H. Oldfield, D. G. Johns, R. M. Blaese. 1997. Mechanism of 'bystander effect' killing in the herpes simplex thymidine kinase gene therapy model of cancer treatment. Gene Ther. 4: 244—251.

Jiao S., P. Williams, R. K. Berg. B. A. Hodgeman, L. Liu, G. Repetto, J. A. Wolff. 1992. Direct gene transfer into nonhuman primate myofibres in vivo. Hum. Gene Ther. 3: 21—33.

Kochanek S., P. R. Clemens, K. Mitani, H.-H. Chen, S. Chan, С. T. Caskey. 1996. A new adenoviral vector: replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and ß-galactosidase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 5731-5736.

Koeberl D. D., I. E. Alexander, C. L. Halbert, D. W. Russell, A. D. Miller. 1997. Persistent expression of human clotting factor IX from mouse liver after intravenous injection of adeno- associated virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 1426-1431.

Lanza R. P., J. L. Hayes, W. L. Chick. 1996. Encapsulated cell technology. Nat. Biotechnol. 14: 1107-1111.

Leib D. A., P. D. Olivo. 1993. Gene delivery to neurons: is herpes simplex virus the right tool for the job? BioEssays 15: 547—554.

Lewis J. G., K.-Y. Lin, A. Kothavale, W. M. Flangan, M. D. Matteucci, R. B. De Prince, R. A. Mook, Jr., R. W. Flendren, R. W. Wagner. 1996. A serum-resistant cytofectin for cellular delivery of antisense oligodeoxynucleotides and plasmid DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3176-3181.

Lyon J., P. Gorner. 1995. Altered Fates: Gene Therapy and the Retooling of Human Life. W. W. Norton & Company, Inc., New York, N.Y.

Michael S. I., D. T. Curiel. 1994. Strategies to achieve targeted gene delivery via the receptor-mediated endocytosis pathway. Gene Ther. 1: 223-232.

Miller A. D. 1992. Human gene therapy comes of age. Nature 357: 455—460.

Mulligan R. C. 1993. The basic science of gene therapy. Science 260: 926—932.

Pochon N. A.-M., B. Fleyd, N. Deglon, J.-M. Joseph, A. D. Zürn, E. E. Baetge, J. P. Hamming, M. Goddard, M. Lysaght, F. Kaplan, A. C. Kato, M. Schluep, L. Flirt, F. Regli, F. Porchet, N. De Tribolet. 1996. Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) using a polymer encapsulated xenogenic cell line engineered to secrete hCNTF. Hum. Gene Ther. 1: 851-860.

Putnam D. A. 1996. Antisense strategies and therapeutic applications. Am. J. Health-Syst. Pharm. 53: 151-160.

Santoro S. W., G. F. Joyce. 1997. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 4262-4266.

Sierakowska Н., М. J. Sambade, S. Agrawal, R. Kole. 1996. Repair of thalassemic human-ß-globin mRNA in mammalian cells by antisense oligonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 12840-12844.

Sun W. H., J. K. Burkholder, J. Sun, J. Culp, J. Turner, X. G. Lu, T. D. Pugh, W. B. Ershler, N. -S. Yang. 1995. In vivo cytokine gene transfer by gene gun reduces tumor growth in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2889-2893.

Tone T., M. Kashani-Sabet, T. Funato, T. Shitara, E. Yoshida, В. I. Kashfian, M. Horng, O. Fodstadt, K. J. Scanlon. 1993. Suppression of EJ cells tumorigenicity. In Vivo 7: 471—476.

Trojan J., B. K. Blossey, T. R. Johnson, S. D. Rudin, M. Tykocinski, J. Dan, J. Dan. 1992. Loss of tumorigenicity of rat glioblastoma directed by episome-based antisense cDNA transcription of insulin-like growth factor 1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4874-4878.

Wagner R. W. 1994. Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides. Nature 372: 333—335. Yoon K., A. Cole-Strauss, E. B. Kmiec. 1996. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNA- DNA oligonucleotide. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 2071-2076.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Что такое генная терапия ex vivo?

2. Опишите использование неаутологичных клеток, модифицированных с помощью генной инженерии, для генной терапии ex vivo. Почему этот подход представляется весьма перспективным?

3. Что такое генная терапия in vivo?

4. Опишите подробно по крайней мере две вирусные системы адресной доставки генов.

5. Опишите подробно по крайней мере три невирусные системы доставки генов.

6. Что такое терапия с использованием «антисмысловых» олигонуклеотидов?

7. С помощью каких модификаций можно увеличить время жизни и повысить эффективность «антисмысловых» олигонуклеотидов как лекарственных средств?

8. Опишите способ лечения злокачественных новообразований с помощью гена HSVtk.

9. Как нужно модифицировать рибозим, чтобы его можно было использовать в качестве лекарственного средства?

10. Как выделяют «терапевтический» аптамер? В чем преимущества аптамеров перед другими видами лекарственных средств?