Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Основы молекулярной биотехнологии
Технология рекомбинантных ДНК
Заключение

Технология рекомбинантных ДНК включает целый набор экспериментальных процедур, благодаря которым удается выделить (клонировать) фрагменты ДНК, содержащие специфические гены. Успех клонирования зависит от возможности воспроизводимо разрезать молекулу ДНК на фрагменты определенного размера. Для точного расщепления ДНК используют рестрицирующие эндонуклеазы типа II. Эти ферменты узнают специфические нуклеотидные последовательности и симметрично разрезают фосфодиэфирные связи в каждой цепи.

Типичный эксперимент по клонированию генов включает следующие этапы. 1. Рестриктазное расщепление ДНК, выделенной из организма, который содержит искомый ген. 2. Обработка вектора для клонирования (обычно плазмидного), который может реплицироваться в клетке-хозяине, теми же рестриктазами, которые использовались для расщепления донорной ДНК. 3. Смешивание этих двух образцов ДНК и сшивание фрагментов ДНК-лигазой фага Т4. 4. Трансформация сшитыми молекулами клеток-хозяев. Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках.

Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся при сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5-концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят: 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию; 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка — продукта клонированного гена; 3) гибридизацию с зондом, комплементарным какому-либо участку искомого гена.

Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе бактериофагов λ и Р1, а также плазмиды F.

Для получения фрагментов ДНК, кодирующих эукариотические белки, на очищенной мРНК как на матрице синтезируют комплементарную цепь ДНК с помощью обратной транскриптазы; эта цепь в свою очередь используется в качестве матрицы для синтеза второй цепи. После ферментативной обработки эту двухцепочечную комплементарную ДНК встраивают в вектор.

Независимо от того, какая именно стратегия клонирования используется, после идентификации клонированной последовательности необходимо показать, что она представляет собой нативный структурный ген.

ЛИТЕРАТУРА

Berger S. L., A. R. Kimme! (ed.). 1987. Methods in Enzymology, vol. 152. Guide to Molecular Cloning Techniques. Academic Press, London, United Kingdom.

Garfin D. E. 1995. Electrophoretic methods, p. 53—109. In J. A. Glasel and M. P. Deutscher (ed.). Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research. Academic Press, San Diego, Calif.

Grinstead J., P. M. Bennett (ed.). 1988. Methods in Microbiology, vol. 21, Plasmid Technology. Academic Press, London, United Kingdom. Ioannou A. P., С. T. Amemiya, J. Games, P. M. Kroisel, H. Shizuya, C. Chen, M. A. Batzer, P. J. de Jong. 1994. A new bacteriophage-derived vector for the propagation of large human DNA fragments. Nat. Genet. 6: 84—89.

Kim U.-J., B. W. Birren, T. Slepak, V. Mancino, C. Boysen, H.-L. Kang, M. I. Simon, H. Shizuya. 1996. Construction and characterization of a human bacterial artificial chromosome library. Genomics 34: 213—218.

Leonardo E. D., J. M. Sedivy. 1990. A new vector for cloning large eukaryotic DNA segments in Escherichia coli. Bio/'lechnology 8: 841- 844. Martin C., L. Bresnick, R.-R. Juo, J. C. Voyta,

I. Bronstein. 1991. Improved chemiluminescent DNA sequencing, BioTechniques 11: 110—114. Old R. W., S. B. Primrose, 1985. Principles of Gene Manipulation, 3rd ed. Blackwell Scientific Publications, Oxford, United Kingdom. Sambrook J., E. F. Fritsch, T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Slightom J. L., R. F. Drong, Р. Р. Chee. 1993. Construction of λ clone banks, p. 121—146. In B. R. Glick and J. E. Thompson (ed.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press, Boca Raton, Fla.

Southern E. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98: 503—507.

Winnacker E.-L. 1987. From Genes to Clones: Introduction to Gene Technology. VCH, New York, N.Y.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Что такое эндонуклеазы рестрикции типа II и почему они так важны для технологии рекомбинантных ДНК?

2. При обработке кольцевой двухцепочечной плазмиды pCELI различными рестриктазами и их комбинациями получаются следующие фрагменты (размеры указаны в парах нуклеотидов): ЕсоRI — 6,0; BamHI — 6,0; HindІII — 6,0; НаеII — 3,0; 2,0 и 1,0; EcoRI и НаеII — 2,0 и 1,0; EcoRI и НіndIII — 3,5 и 2,5; EcoRI и ВаmHI - 4,5 и 1,5; ВаmHI и HindIII - 5,0 и

1,0; ВаmHI и НаеII - 3,0; 1,5 и 0,5; НіndIII и HaeII — 3,0; 1,5; 1,0 и 0,5. Используя эти данные, постройте рестрикционную карту рСЕLI

3. Опишите применение плазмиды pBR322 в качестве вектора. Какими особенностями она обладает?

4. Опишите основные свойства системы клонирования pUC.

5. Обычно банк клонов создают лигированием плазмидного вектора, подвергнутого исчерпывающему гидролизу с помощью ВаmHI, с хромосомной ДНК, частично гидролизованной рестриктазой Sau3Al.

а. Почему в этом эксперименте используется два разных фермента?

б. Что такое частичный гидролиз и как его проводят?

в. Почему к нему часто прибегают для создания банков клонов?

6. Зачем рестрицированную плазмидную ДНК перед лигированием часто обрабатывают щелочной фосфатазой?

7. Опишите способы введения рекомбинантных плазмид в грамотрицательную бактерию, например в Е. coli.