Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002
Основы молекулярной биотехнологии
Получение рекомбинантных белков с помощью эукариотических систем
Заключение
Прокариотические системы экспрессии успешно используются для синтеза многих белков. Однако некоторые белки для превращения в активную форму должны претерпеть специфические посттрансляционные модификации — гликозилирование, фосфорилирование или ацетилирование, а бактерии к этому не способны. Поэтому было решено попытаться экспрессировать клонированные гены в эукариотических клетках с помощью специально созданных эукариотических экспрессирующих векторов.
Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, использовались дрожжи S. cerevisiae. Их генетика хорошо изучена, а кроме того, их можно выращивать в больших ферментерах. Чтобы упростить очистку белков, были сконструированы векторы, обеспечивающие их секрецию. С помощью S. cerevisiae было получено множество самых разных аутентичных белков. Однако многие рекомбинантные белки в этой системе не подвергались посттрансляционной модификации, к тому же их выход зачастую был недостаточно высок. Поэтому были предприняты попытки разработать другие дрожжевые системы синтеза рекомбинантных белков.
В поисках других эукариотических систем экспрессии, с помощью которых можно было бы получать биологически активные белки, исследователи сосредоточили усилия на создании экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов, в частности бакуловируса AcMNPV, инфицирующего клетки многих насекомых. Исходная стратегия предполагала трансфекцию клеток насекомого, зараженных AcMNPV, транспортным вектором, который содержал клонированный ген, фланкированный AcMNPV-специфичными последовательностями. В результате двойного кроссинговера между вектором и геном AcMNPV клонированный ген встраивался в последний и попадал под контроль сильного промотора, функционирующего на последних стадиях литического цикла. Клетки насекомого, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом, синтезировали гетерологичный белок.
Частоту появления рекомбинантных бакуловирусов удалось повысить с менее чем 1% до 99%. Для этого ДНК AcMNPV обрабатывали эндонуклеазой рестрикции, которая расщепляла ДНК в двух специфичных сайтах с высвобождением фрагмента, несущего часть гена, необходимого для осуществления литического цикла. Клетки насекомого трансфицировали этим фрагментом, а затем — транспортным вектором. В результате двойного кроссинговера в некоторых клетках восстанавливался кольцевой геном AcMNPV, который содержал клонированный ген и функциональный ген, необходимый для осуществления литического цикла. В результате почти все вирулентные бакуловирусы оказывались рекомбинантными.
Следующий шаг в усовершенствовании системы экспрессии на основе бакуловирусов состоял в создании бакмиды, челночного вектора Е. соli/клетки насекомого, позволяющего проводить все генноинженерные манипуляции в Е. coli. Клетки насекомого трансфицировали рекомбинантной бакмидой только с целью получения гетерологичного белка. Примерно 95% гетерологичных белков, синтезированных в системах экспрессии на основе бакуловирусов, имели соответствующие посттрансляционные модификации.
Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих обычно применяют для синтеза гетерологичных белков, использующихся в научных или медицинских целях. Они представляют собой челночные векторы с сайтами инициации репликации вируса животных и Е. coli-плазмиды. Регуляторные элементы транскрипции обычно происходят из генома вируса животных или из геномов млекопитающих. Для отбора трансфицированных клеток используют доминантные селективные маркерные гены. Некоторые системы отбора основаны на введении в среду возрастающего количества цитотоксичного соединения и позволяют получать клетки, содержащие большое число копий вектора, что увеличивает выход чужеродного белка.
Разработаны системы экспрессии млекопитающих, позволяющие получать белки, состоящие из двух разных субъединиц. Для этого хозяйские клетки трансфицировали сразу двумя векторами, каждый из которых нес ген одной из субъединиц. Альтернативный подход состоял в использовании одного вектора, который нес эти два гена в виде отдельных единиц транскрипции или в виде одного транскриптона, содержащего оба этих гена.
ЛИТЕРАТУРА
Cockett М. L, С. R. Beddington, G. Т. Yarranton. 1990. High level expression of tissue inhibitor or metalloproteinases in Chinese hamster ovary cells using glutamine synthetase gene amplification. Bio/Technology 8: 662—667.
Cole E. S., K. Lee, K. Lauziere, C. Kelton, S. Chappel, B. Weintraub, D, Ferrara, P. Peterson, R. Bernasconi, T. Edmunds, S. Richards, L. Dickrell, I. M. Kleeman, J. H. McPherson, В. M. Pratt. 1993. Recombinant human thyroid stimulating hormone: development of a biotechnology product for detection of metastatic lesions of thyroid carcinoma. Bio/Technology 11: 1014-1024.
Cregg J. M., J. F. Tschopp, C. Stillman, R. Siegel, M. Akong, W. S. Craig, R. G. Buckholz, K. R. Madden, P. A. Kellaris, G. R. Davis, B. L. Smiley, J. Cruze, R. Torregrossa, G. Velicelebi,
G. P. Thill. 1987. High-level expression and efficient assembly of hepatitis В surface antigen in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Bio/Technology 5: 479—485.
Davies A. H. 1994. Current methods for manipulating baculovirus. Bio/Technology 12: 47—50. Digan M. E., S. V. Lair, R. A. Brierley, R. S. Siegel, M. E. Williams, S. B. Ellis, P. A. Kellaris, S. A. Provow, W. S. Craig, G. Velicelebi, M. M. Harpold, G. P. Thill. 1989. Continuous production of a novel lysozyme via secretion from the yeast, Pichia pastoris. Bio/Technology 7: 160-164.
Dirks W., M. Wirth, H. Hauser. 1993. Dicistronic transcription units for gene expression in mammalian cells. Gene 128: 247—249.
Gellissen G., Z. A. Janowicz, U. Weydemann, K. Melber, A. W. M. Strasser, С. P. Hollenberg. 1992. High-level expression of foreign genes in Hansenula polymorpha. Biotechnol. Adv. 10: 179-189.
Giga-Hama Y., H. Tohda, H. Okada, M. К. Owada, Н. Okayama, Н. Kumagai. 1994. High-level expression of human lipocortin 1 in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe using a novel expression vector. Bio/Technology 12: 400-404.
Gilbert S. С., H. van Urk, A. J. Greenfield, M. J. McAvoy, K. A. Denton, D. Coghlan, G. D. Jones, D. J. Mead. 1994. Increase in copy number of an integrated vector during continuous culture of Hansenula polymorpha expressing functional human hemoglobin. Yeast 10: 1569-1580.
The Global Use of Strategies to Open Occluded Arteries (GUSTO) lib Investigators. 1996. A comparison of recombinant hirudin with heparin for the treatment of acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 335: 775-782.
Hallewell R. A., R. Mills, P. Tekamp-Olson, R. Blacher, S. Rosenberg, F. Otting, F. R. Masiarz, C. J. Scandella. 1987. Amino terminal acetylation of authentic human Cu, Zn superoxide dismutase produced in yeast. Bio/Technology 5: 363-366.
Kidd I. M., V. C. Emery. 1993. The use of baculoviruses as expression vectors. Appl. Blochem. Biotechnol. 42: 137—159.
Kitts P. A., R. D. Possee. 1993. A method for producing recombinant baculovirus expression vectors at high frequency. BioTechniques 14: 810-817.
Laroche Y., V. Strome, J. DeMeutter, J. Messens, M. Lauwereys. 1994. High-level secretion and very efficient isotopic labeling of tick anticoagulant peptide (TAP) expressed in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Bio/Technology 12: 1119-1124.
Loison G., A. Findeli, S. Bernard, M. Nguyen- Juilleret, M. Marquet, N. Riehl-Bellon, D. Carvallo, L. Guerra-Santos, S. W. Brown, M. Courtney, C. Roitsch, Y. Lemoine. 1988. Expression and secretion in S. cerevisiae of biologically active leech hirudin. Bio/Technology 6: 72-77.
Lucas B. K., L. M. Giere, R. A. DeMarco, A. Shen, V. Chisholm, C. W. Crowley. 1996. High-level production of recombinant proteins in CHO cellsusing a dicistronic DHFR intron expression vector. Nucleic Acids Res. 24: 1774—1779.
Lucknow V. A., S. C. Lee, G. F. Barry, P. O. Olins.
1993. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertioin of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J. Virol. 67: 4566-4579.
Peng S., M. Sommerfeit, J. Logan, Z. Huang, T. Jilting, K. Kirk, E. Hunter, E. Sorscher. 1993. One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect expression system. Protein Expr. Purif. 4: 95—100.
Robinson A. S., Y. Hines, K. D. Wittrup. 1994. Protein disulfide isomerase overexpression increases secretion of foreign proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio/Technology 12: 381-384.
Romanos M. A., C. A. Scorer, J. J. Clare. 1992. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast 8: 423-488.
Vozza L. A., L. Wittmer, D. R. Higgins, T. J. Purcell, M. Bergseid, L. A. Collins-Racie, E. R. LaVallie, J. P. Hoeffler. 1996. Production of a recombinant bovine enterokinase catalytic subunit in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Bio/ Technology 14: 77—81.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Почему для получения белков, использующихся в медицине, лучше применять эукариотические, а не прокариотические системы?
2. Какие достоинства и недостатки имеют различные типы дрожжевых векторов, предназначенных для получения данного рекомбинантного продукта?
3. Опишите основные свойства интегративной векторной системы Р. pastoris, обладающей высоким уровнем экспрессии.
4. Что такое бакуловирусы? Опишите исходную систему экспрессии на основе бакуловирусов и ее последующие модификации.
5. Что такое бакмида? Для чего ее используют?
6. Что такое аффинная метка? Для чего ее используют?
7. Опишите основные свойства внехромосомного экспрессирующего вектора млекопитающих.
8. Опишите как минимум две селективные системы, использующиеся в случае экспрессирующих векторов млекопитающих.
9. Опишите разные подходы к созданию систем синтеза двух рекомбинантных белков в одной клетке млекопитающего.
10. Какими критериями руководствуются при выборе системы экспрессии генов гетерологичных белков (дрожжи, система экспрессии на основе бакуловирусов, клетки млекопитающих)?