Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Бактерии, стимулирующие рост растений
Заключение

Многие почвенные микроорганизмы обладают способностью стимулировать рост растений. Были исследованы молекулярные механизмы, лежащие в основе этой стимуляции, с тем чтобы выяснить, можно ли использовать полезные почвенные бактерии вместо химических удобрений. Полезные бактерии могут оказывать свое влияние непосредственно, поставляя растениям фиксированный азот, хелатированное железо, фитогормоны или облегчая поглощение ими фосфора. Но влияние может быть и опосредованным, через подавление роста фитопатогенных микроорганизмов.

Из всех бактерий, стимулирующих рост растений и уже использующихся в сельском хозяйстве, наиболее детально изучены члены семейства Rhizobium и Bradyrhizobium. Эти микроорганизмы вступают в сложные облигатные симбиотические отношения со строго определенными растениями.

Молекулярные основы фиксации азота всесторонне исследовались на К. pneumoniae, которая может служить модельной системой для изучения симбиотических бактерий семейств Rhizobium и Bradyrhizobium. Детально охарактеризована нитрогеназа, азотфиксирующий фермент. Молекулярно-генетические исследования показали, что фиксация азота бактериями — это сложный процесс; в нем участвует семь координированно регулируемых оперонов, кодирующих в общей сложности 20 разных белков. Это делает пока невозможным создание с помощью методов генной инженерии растений, которые могли бы сами усваивать азот, и других азотфиксирующих бактерий.

Азотфиксирующий фермент нитрогеназа, используя энергию гидролиза АТР, катализирует образование газообразного водорода (Н₂). Некоторые штаммы Rhizobium синтезируют фермент гидрогеназу. Он катализирует превращение in vivo Н₂ в Н⁺, что увеличивает эффективность фиксации азота. Если штамм содержит неактивную гидрогеназу, его способность фиксировать азот и стимулировать рост растения уменьшается. С учетом всего сказанного выше были предприняты попытки ввести клонированные гены гидрогеназ в штаммы Rhizobium, вступающие в симбиотические отношения с сельскохозяйственными культурами. По предварительным данным, проводя генноинженерные модификации генов гидрогеназ, можно создать штаммы Rhizobium, обладающие более высокой способностью стимулировать рост растений.

Вступая в симбиотические отношения с растениями, штаммы Rhizobium стимулируют образование на их корнях клубеньков, где и происходит размножение этих бактерий и фиксация азота. Разумно было предположить, что, если с помощью методов генной инженерии удастся создать бактерии, способствующие образованию большего количества клубеньков, конкурентоспособность инокулирующих штаммов Rhizobium в борьбе за место на корнях растений-симбионтов повысится по сравнению со штаммами дикого типа. К сожалению, обнаружилось, что в образовании клубеньков участвует множество разных генов, и эта сложность затрудняет проведение соответствующих молекулярно-генетических экспериментов.

Опосредованная стимуляция роста растений бактериями состоит в защите растений от повреждений, вызываемых фитопатогенными грибами или бактериями. Такая защита осуществляется при участии специфических соединений, синтезируемых бактериями, которые стимулируют рост растений: сидерофоров, антибиотиков, других малых молекул и различных ферментов. Некоторые другие продукты синтеза, в частности фитогормоны и АЦК—дезаминаза, влияют на рост растений непосредственно. Есть надежда, что когда-нибудь гены биосинтеза всех перечисленных соединений можно будет использовать для создания бактерий — более эффективных стимуляторов роста растений.

ЛИТЕРАТУРА

Adams М. W. W., L. Е. Mortenson, J. S. Chen. 1981. Hydrogenase. Biochim. Biophys. Acta 594:105-176.

Albrecht S. L., R. J. Maier, F. J. Hanus, S. A. Russell, D, W. Emerich, H. J. Evans. 1979. Hydrogenase in Rhizobium japonicum increases nitrogen fixation by nodulated soybeans. Science 203: 1255-1257.

Arp D. J. 1990. H₂ cycling in N₂ fixation: past, present, and future outlook, p. 67-76. In P. M. Gresshoff, L. E. Roth, G. Stacey, W. E. Newton (ed.), Nitrogen Fixation: Achievements and Objectives. Chapman & Hall, New York, N.Y.

Bar-Ness E., Y. Chen, Y. Hadar, H. Marschner, V. Römheld. 1991. Siderophores of Pseudomonas putida as an iron source for dicot and monocot plants, p. 271—281. In Y. Chen, Y. Hadar (ed.), Iron Nutrition and Interactions in Plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.

Cantrell M. A., R. A. Haugland, H. J. Evans. 1983. Construction of a Rhizobium japonicum gene bank and use in isolation of a hydrogen uptake gene. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 181—185.

Chet L, J. Inbar. 1994. Biological control of fungal pathogens. Appl. Blochem. Biotechnol. 48: 37—43.

Crosa J. H. 1989. Genetics and molecular biology of siderophore-mediated iron transport in bacteria. Microbiol. Rev. 53: 517—530.

Evans H. J., A. R. Harker, H. Papen, S. A. Russell, F. J. Hanus, M. Zuber. 1987. Physiology, biochemistry, and genetics of the uptake hydrogenase in Rhizobia. Annu. Rev. Microbiol. 41: 335-361.

Fischer H.-M. 1994. Genetic regulation of nit rogen fixation in Rhizobia. Microbiol. Rev. 58: 352-386.

Click B. R. 1995. The enhancement of plant growth by free-living bacteria. Can. J. Microbiol. 41: 109-117.

Click B. R., Y. Bashan. 1997. Genetic manipulation of plant growth-promoting bacteria to enhance biocontrol of phytopathogens. Biotechnol. Adv. 15: 353-378.

Glick B. R., С. B. Jacobson, M. M. K. Schwarze, J. J. Pasternak. 1994. 1-Aminocyclopropane-l- carboxylic acid deaminase mutants of the plant growth-promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 do not stimulate canola root elongation. Can. J. Microbiol. 40: 911—915.

Click B. R., D. M. Penrose, J. Li. A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth-promoting bacteria. J. Theor. Biol., in press.

Glick B. R., J. Zeisler, A. M. Banaszuk, J. D. Friesen, W. G. Martin. 1981. The identification and partial characterization of a plasmid containing the gene for the membrane-associated hydrogenase from E. coli. Gene 15: 201—206.

Gresshoff P. M., L. E. Roth, G. Stacey, W. E. Newton (ed.). I 990. Nitrogen Fixation: Achievements and Objectives. Chapman & Hall, New York, N.Y.

Hennecke H. 1990. Nitrogen fixation genes involved in the Bradyrhizobium japonicum-soybean symbiosis. FEBS Fett. 268: 422—426.

Higashi S. 1993. (Brady) Rhizobium-plant communications involved in infection and nodulation. J. Plant Res. 106: 201-211.

Jones D. A., M. H. Ryder, B. G. Clare, S. K. Farrand, A. Kerr. 1988. Construction of a Tra — deletion mutant of a pAgK84 to safeguard the biological control of crown gall. Mol. Gen. Genet. 212: 207-214.

Kloepper J. W., R. Lifshitz, M. N. Schroth. 1988. Pseudomonas inoculants to benefit plant production. IS I Atlas Sсi. Anim. Plant Sei. 60—64.

Layva A., J. M. Palacios, T. Mozo, T. Ruiz-Argiieso. 1987. Cloning and characterization of hydrogen uptake genes from Rhizobium leguminosarum. J. Bacteriol. 169: 4929—4934.

Lerouge P., P. Roche, C. Faucher, F. Maillet, G. Truchet, J. C. Prome, J. Denarie. 1990. Symbiotic host-specificity of Rhizobium meliloti is determined by a sulphated and acylated oligosaccharide signal. Nature 344: 781—784.

Long S. R., W. J. Buikema, F. M. Ausubel. 1982. Cloning of Rhizobium meliloti nodulation genes by direct complementation of Nod mutants. Nature 298: 485-488.

Lynch J. M. 1990. Beneficial interactions between microorganisms and roots. Biotechnol. Adv. 8: 335-346.

Marugg J. D., M. van Spanje, W. P. M. Hoekstra, B. Schippers, P. J. Weisbeek. 1985. Isolation and analysis of genes involved in siderophore biosynthesis in plant-growth-stimulating Pseudomonas putida WC358. J. Bacteriol. 164: 563—570.

Marugg J. D., H. B. Nielander, A. J. G. Horrevoets, I. van Megen, I. van Genderen, P. J. Weisbeek. 1988. Genetic organization and transcriptional analysis of a major gene cluster involved in siderophore biosynthesis in Pseudomonas putida WCS358. J. Bacteriol. 170: 1812-1819.

Morris R. O. 1986. Genes specifying auxin and cytokinin biosynthesis in phytopathogens. Annu. Rev. Plant Physiol. 37: 509—538.

Mylona P., K. Pawłowski, T. Bisseling. 1995. Symbiotic nitrogen fixation. Plant Cell 7: 869-885.

Nap J.-P., T. Bisseling. 1990. Developmental biology of a plant-prokaryote symbiosis: the legume root nodule. Science 250: 948—954.

Neilands J. B., S. A. Leong. 1986. Siderophores in relation to plant growth and disease. Annu. Rev. Plant Physiol. 37: 187-208.

O’Sullivan D. J., F. O'Gara. 1992. Traits of fluorescent Pseudomonas spp. involved in suppression of plant root pathogens. Microbiol. Rev. 56: 662-676.

Paau A. S. 1991. Improvement of Rhizobium inoculants by mutation, genetic engineering, and formulation. Biotechnol. Adv. 9: 173—184.

Patten C. L., B. R. Glick. 1996. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid. Can. J. Microbiol. 42: 207-220.

Peters J. W., K. Fischer, D. R. Dean. 1995. Nitrogenase structure and function: a biochemical-genetic perspective. Annu. Rev. Microbiol. 49: 335-366.

Rossen L., E. O. Davis, A. W. B. Johnston. 1987. Plant-induced expression of Rhizobium genes involved in host specificity and early stages of nodulation. Trends Biol. Sci. 12: 430—433.

Schnider U., C. Keel, C. Blumer, J. Troxler, G. Defago, D. Haas. 1995. Amplification of the housekeeping sigma factor in Pseudomonas fluorescents CHAO enhances antibiotic production and improves biocontrol abilities. J. Bacteriol. 177: 5387-5392.

Spaink H. P., C. A. Wijffelman, E. Pees, R. J. H. Okker, B. J. J. Lugtenberg. 1987 Rhizobium nodulation gene nodD as a determinant of host specificity. Nature 328: 337-340.

Sprent J. 1. 1986. Benefits of Rhizobium to agriculture. Trends Biotechnol. 4: 124— 129.

Stacey G. 1995. Bradyrhizobium japonicum nodulation genetics. FEMS Microbiol. Lett. 127: 1—9.

Sun X., M. Griffith, J. J. Pasternak, B. R. Glick. 1995. Low temperature growth, freezing survival and production of antifreeze protein by the plant growth-promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2. Can. J. Microbiol. 41: 776—784. van Rhijn P., J. Vanderleyden. 1995. The Rhizobiumplant symbiosis. Microbiol. Rev. 59: 124—142.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Предположим, что у вас есть штамм Rhizobium japonicum, способный усваивать азот и вступающий в симбиотические отношения с растениями сои. Какой подход вы использовали бы для идентификации кластера генов, кодирующих образование клубеньков, при условии, что у вас нет зонда для гибридизации с nod-генами?

2. Что такое гидрогеназа? Как с ее помощью можно повысить урожайность люцерны?

3. Предложите стратегию идентификации всех генов Azotobacter vinelandii, участвующих в связывании азота, имея в виду, что у вас нет w z/¹ генов других микроорганизмов, которые можно было бы использовать в качестве гиб- ридизационных зондов.

4. Как, по вашему мнению, повлияет внесение мутаций в nifA- или nifL-гены на количество фиксируемого данным организмом азота?

5. Обсудите возможность создания рекомбинантных растений, способных фиксировать азот.

6. Предложите схему выделения генов гидрогеназы.

7. Что такое сидерофоры? Каким образом, модифицируя гены сидерофоров, можно повысить способность бактерий стимулировать рост растений?

8. Предложите схему идентификации генов биосинтеза сидерофоров.

9. В чем преимущество микробиологических удобрений перед химическими?

10. Как с помощью методов генной инженерии повысить эффективность Agrobacterium radiobacter как инструмента биоконтроля?

11. Какие ферменты, секретируемые стимулирующими рост растений бактериями, обусловливают их «биоконтролирующие» свойства? Каков механизм действия этих ферментов?