Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Микробные инсектициды
Бакуловирусы как инструмент биоконтроля

Механизм действия

Бакуловирусы — палочкообразные вирусы с двухцепочечным ДНК-геномом, инфицирующие разнообразных беспозвоночных. Различные подгруппы этого семейства патогенны для таких отрядов насекомых, как чешуекрылые, перепончатокрылые, двукрылые, сетчатокрылые, ручейники, жесткокрылые и равнокрылые. Некоторые из них играют важную роль в контроле численности определенных насекомых-вредителей в природных условиях. Бакуловирусы использовали в Северной Америке, начиная с 1930-х гг., до появления химических пестицидов в 1960-х гг., для борьбы с вредителями лесов, в том числе с пилильщиком еловым (Neodiprion sertifer), и продолжают применять, хотя и в меньшем масштабе, для контроля популяций непарного шелкопряда (Lymantria dispar) (табл. 15.3). Вирион бакуловируса имеет цилиндрический нуклеокапсид, в котором заключена его ДНК. Попав в ядро инфицированной клетки, бакуловирусные частицы объединяются, образуя компактную структуру, заключенную в кристаллический белковый матрикс. Он состоит в основном из белка полиэдрина. После гибели инфицированных насекомых в среду выходят миллионы полиэдриновых частиц. Попадая в кишечник других насекомых, они подвергаются действию щелочной среды, матрикс растворяется и высвобождаются инфекционные вирусные частицы. Они проникают в клетки кишечника насекомых, через цитоплазму попадают в ядро, где после удаления нуклеокапсида происходит репликация вируса и образование новых вирусных частиц. Некоторые из них попадают в кровоток насекомого, отшнуровываясь от плазматической мембраны инфицированных клеток, а затем и в другие органы. Обычно насекомое погибает по прошествии 10 раундов репликации вируса, т. е. примерно через 5—6 сут после инфекции, при этом до 25% сухой массы насекомого приходится на долю полиэдрина.

Таблица 15.3. Некоторые насекомые-вредители, для контроля численности которых применяют бакуловирусы

Одно из преимуществ бакуловирусов как инструмента биоконтроля численности насекомых состоит в избирательности их действия. С одной стороны, это означает, что данный бакуловирус может использоваться для контроля численности только определенных насекомых-вредителей. Но с другой, благодаря тому что бакуловирусы эволюционировали в течение многих тысяч лет совместно со своими насекомыми-хозяевами, они научились преодолевать их защитные механизмы, а потому устойчивость к этим вирусам развивается крайне редко — гораздо реже, чем к В. thuringiensis. Более того, устойчивые к бакуловирусам насекомые быстро утрачивают эту способность после того, как прекращают взаимодействовать с вирусами.

Фермеры и садоводы предпочитают использовать один инсектицидный агент, действующий на различных насекомых-вредителей, а не множество инсектицидов. Это означает, что для более широкого применения бакулирусов необходимо расширить круг их хозяев.

Было показано, что при одновременном инфицировании клетки насекомого двумя штаммами бакуловирусов после их репликации иногда появляются новые штаммы, немного отличающиеся по своим действиям от исходных вирусов. Причиной этому является гомологичная рекомбинация между ДНК разных вирусов. Детальное изучение этого явления показало, что рекомбинация осуществляется в пределах участка ДНК длиной всего 79 нуклеотидов, расположенного в гене геликазы р143. Возможно, этот участок и определяет круг хозяев различных бакуловирусов. Учитывая все это, можно предположить, что замена в нем некоторых нуклеотидов позволит создавать бакуловирусы с более широкой специфичностью.

Усиление биоконтроля с помощью генной инженерии

Бакуловирусы не оказывают свое действие мгновенно. В зависимости от условий инфицированное насекомое может погибнуть за период от нескольких дней до нескольких недель. Чтобы ускорить этот процесс, попытались увеличить вирулентность бакуловирусов введением в них чужеродных генов, в результате экспрессии которых произойдет ослабление инфицированного насекомого или его гибель (табл. 15.4). В одном из экспериментов предполагалось использовать ген, экспрессия которого в клетках насекомого-хозяина нарушает его нормальный жизненный цикл. Известно, что понижение уровня ювенильного гормона у личинок инициирует окукливание и приводит к прекращению их активного питания. Это снижение происходит в результате повышения содержания специфической эстеразы, катализирующей превращение биологически активной формы сложного метилового эфира ювенильного гормона в неактивную кислую форму. Ингибирование активности эстеразы приводит к накоплению in vivo активного ювенильного гормона, личинки дольше остаются на стадии активного питания и в результате достигают гигантских размеров. Разумно было предположить, что при искусственном повышении уровня экстеразы ювенильного гормона произойдет понижение уровня эндогенного активного ювенильного гормона и преждевременное прекращение питания. К тому же было известно, что при уменьшении времени активного питания личинок урожаю наносится меньший ущерб.

Таблица 15.4. Эффект некоторых генов, введенных в бакуловирусы для повышения их инсектицидного действия¹⁾

¹⁾ Из работы Maeda, Curr. Opin. Biotechmt. 6: 313—319, 1995.

Чтобы проверить это предположение, пришлось сначала провести эксперименты по клонированию и экспрессии гена эстеразы ювенильного гормона. Фермент выделили из насекомого Heliothis virescens (совки) и очистили. Определили его аминокислотную последовательность, синтезировали олигонуклеотид, соответствующий одному из сегментов белковой молекулы, и использовали его в качестве зонда для гибридизации. Из библиотеки кДНК Н. virescens выделили кодирующую последовательность для эстеразы ювенильного гормона и встроили ее в геном бакуловируса так, чтобы она находилась под транскрипционным контролем вируса. После обработки таким рекомбинантным бакуловирусом Trichoplusia nі (совки ни), находящейся на первой личиночной стадии развития, содержание ювенильного гормона у насекомого снизилось, а рост личинок резко замедлился по сравнению с таковыми контрольных личинок, обработанных бакуловирусом дикого типа.

К сожалению, применимость этого подхода для повышения эффективности инсектицидного действия бакуловирусов ограничивается тем, что ухудшение питания личинок при повышении уровня эстеразы ювенильного гормона происходит только на первой стадии развития личинок. Личинки, находящиеся на других стадиях развития, гораздо менее чувствительны к обработке бакуловирусами. Таким образом, бакуловирусы, специально сконструированные для экспрессии гена эстеразы ювенильного гормона, эффективны лишь тогда, когда личинки большей части популяции насекомого-вредителя находятся на первой стадии развития, что в естественных условиях почти недостижимо.

Другой подход к повышению эффективности инсектицидного действия бакуловирусов основан на включении в вирусный геном гена мощного насекомоспецифичного токсина, который экспрессировался бы во время цикла вирусной инфекции. В один из штаммов бакуловируса был введен ген насекомоспецифичного нейротоксина, синтезируемого североафриканским скорпионом, Androctonus australis Hector. Этот нейротоксин, не оказывающий никакого действия на мышей, блокирует транспорт ионов натрия в нейронах насекомых-мишеней, что приводит к параличу и смерти. Насекомые, которые были инфицированы бакуловирусом, несушим ген нейротоксина скорпиона, повреждали листья контрольных растений на 50% меньше, чем насекомые, инфицированные бакуловирусом дикого типа.

Клонирование и экспрессия кДНК токсина израильского желтого скорпиона, Leiurus quinquestriatus Hebraeus, в бакуловирусе Autographa californica привело к уменьшению времени, которое необходимо для уничтожения 50% личинок контрольного насекомого, со 120 до 78 ч. Кроме того, через 120 ч после инфекции личинки насекомого, обработанные рекомбинантным вирусом, набрали втрое меньший вес по сравнению с личинками, обработанными вирусом дикого типа. Таким образом, рекомбинантный бакуловирус не только ускорял гибель инфицированных личинок, но и существенно уменьшал способность насекомых повреждать растения.

Не так давно рекомбинантный бакуловирус A. californica, продуцирующий насекомоспецифичный нейротоксин Androctonus australis, был протестирован в полевых условиях. В проведенных ранее лабораторных экспериментах наблюдалось уменьшение времени, необходимого для уничтожения насекомого Т. nі, на 25—50%, но еще больший эффект оказывал рекомбинантный бакуловирус в контрольных полевых испытаниях (рис. 15.7): он быстрее приводил к гибели насекомых, снижал ущерб, причиняемый растениям капусты, сокращал число вредителей в следующем цикле репродукции. Какую бы эффективность ни обнаруживал конкретный рекомбинантный бакуловирус в лабораторных экспериментах, основным препятствием на пути его широкомасштабного применения является высокая стоимость его препаратов и трудность распространения. Бакуловирусы — это облигатные паразиты, они могут размножаться только в живом организме или в культуре клеток насекомого. Стоимость препаратов бакуловирусов, независимо от того, является вирус рекомбинантным или нет, гораздо выше, чем химических инсектицидов. И тем не менее не исключено, что биологические инсектициды найдут более широкое применение, если учесть, какое неблагоприятное воздействие на окружающую среду оказывают химические инсектициды, т. е. если сопоставить их стоимость и выгоду, которую они дают.

Рис. 15.7. Выживаемость личинок Т. nі после обработки листьев капусты бакуловирусом дикого типа или рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим ген нейротоксина скорпиона. На контрольные растения наносили только личинок насекомых. Чем ниже выживаемость, тем больше личинок погибло и тем больше эффективность обработки. Растения обрабатывали бакуловирусами только один раз в начале эксперимента.