ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I - Л. В. Красникова - 2016

10. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ

Число клеток микроорганизмов в единице объема или массы продукта можно определить либо непосредственным их подсчетом под микроскопом, либо путем подсчета колоний, выросших на питательных средах при посеве разведений продукта, или другими методами.

Кроме того, в микробиологической практике часто определяют биомассу - массу сухого вещества клеток, выраженную в граммах, выросшую в определенном объеме питательной среды. Непосредственный подсчет клеток проводят в счетных камерах, на фиксированных окрашенных мазках и на мембранных фильтрах. При непосредственном подсчете микроорганизмов под микроскопом учитывают, как живые, так и мертвые клетки, что дает завышенные результаты о числе жизнеспособных клеток в субстрате.

10.1. Подсчет клеток микроорганизмов в камере Горяева

Цель работы: произвести подсчет клеток суспензии дрожжей в камере Горяева.

В камерах Горяева, Тома-Цейса и других можно произвести подсчет только крупных клеток микроорганизмов - дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых крупных бактерий.

Счетная камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло, разделенное четырьмя прорезями на три поперечные площадки. Центральная площадка продольной прорезью делится пополам. На каждой половинке выгравирована сетка. Площадь квадрата сетки и глубина камеры указаны на предметном стекле и равны соответственно 1/25 (большой квадрат) и 1/400 мм² (малый квадрат). Глубина камеры равна 0,1 или 0,2 мм.

Суспензию дрожжей перед подсчетом клеток разбавляют водой в зависимости от предполагаемой их концентрации. На поверхность сетки камеры Горяева наносят небольшую каплю исследуемой суспензии микроорганизмов, накрывают специальным шлифованным покровным стеклом и притирают его к боковым площадкам до появления так называемых Ньютоновых колец. Подсчет клеток рекомендуется начинать не раньше, чем через 3-5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и расположились в одной плоскости. Клетки подсчитывают с объективом 8х или 40х. Для получения достоверных результатов подсчет следует проводить в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали, при этом количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом - 10. В противном случае суспензию следует развести водопроводной водой.

Количество клеток в 1 см суспензии вычисляют по формуле

С = а • 1000 • n/hS,

где С - число клеток в 1 см³ суспензии; а - среднее число клеток в квадрате сетки; 1000 мм2 = 1 см³; n - разведение исходной суспензии; h - глубина камеры в мм; S - площадь квадрата сетки в мм².

10.2. Непосредственный подсчет клеток под микроскопом (метод Виноградского-Брида)

Цель работы: произвести подсчет клеток лактобацилл в кисломолочном продукте.

Преимущество этого метода, по сравнению с учетом клеток в счетной камере, заключается в возможности подсчитывать клетки микроорганизмов малых размеров, так как подсчет проводят с использованием иммерсионного объектива.

Препарат готовят следующим образом. Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечают квадрат площадью 4 см², и обводят его стеклографом или тушью. Готовят суспензию микроорганизмов, для чего 1 см³ кисломолочного продукта вносят в пробирку с 9 см физиологического раствора (n = 10). Затем на предметное стекло наносят микропипеткой строго определенный объем исследуемой суспензии микроорганизмов (обычно 0,01 или 0,02 см³). Тщательно распределяют суспензию бактериологической петлей по всей площади квадрата, отмеченного на стекле. Препарат подсушивают на воздухе, фиксируют в пламени спиртовки, окрашивают в течение 2 мин метиленовым синим, промывают водой и осушают фильтровальной бумагой. На препарат наносят каплю кедрового масла и рассматривают с иммерсионным объективом. Чтобы результат был достоверным, подсчет числа клеток рекомендуется проводить не менее чем в 20 полях зрения. Общее количество подсчитанных клеток должно быть не менее 600. В мазке микроорганизмы распределяются неравномерно: в центре их содержится больше, чем по краям. Поэтому для получения среднего значения следует вести подсчет по диаметру мазка, смещая поле зрения от одного конца диаметра к другому.

Количество клеток в 1 см суспензии вычисляют по формуле

С = а • S • n/s • V,

где С - число клеток в 1 см³ суспензии; а - среднее число клеток в одном поле зрения; S - площадь приготовленного мазка (400 мм²); n - разведение исходной суспензии; s - площадь поля зрения (0,02 мм²; V - объем нанесенной на предметное стекло суспензии микроорганизмов (0,01 или 0,02 см³).

10.3. Прямой подсчет количества микроорганизмов флуоресцентным методом

Флуоресцентная микроскопия основана на способности некоторых биологических объектов люминесцировать, т. е. светиться при освещении ультрафиолетовым или синим светом вследствие того, что свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). При этом объекты будут светиться желто-зеленым или оранжевым светом. Это собственная или первичная люминесцения. Поскольку большинство микроорганизмов не обладает собственной люминесценцией, существует несколько способов их обработки для наблюдения в люминесцентном микроскопе. Прежде всего это окрашивание их специальными красителями флуорохромами - сильно разбавленными растворами флуоресцирующих красителей. Из синтетических флуорохромов наилучшие результаты дают акридин желтый или оранжевый, корифосфин, примулин, родамин. Такой вид люминесцении в отличие от первичной носит название наведенной (вторичной).

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычной позволяет:

✵ сочетать цветное изображение и контрастность объектов;

✵ исследовать как прозрачные, так и непрозрачные живые объекты;

✵ изучать морфологию как живых, так и мертвых клеток микроорганизмов;

✵ исследовать клеточные микроструктуры, избирательно поглощающие различные флуорохромы, и определять функциональноморфологические изменения клеток;

✵ исследовать различные жизненные процессы в динамике их развития.

Микробные клетки окрашивают акридиновым оранжевым и концентрируют их на фильтрах методом центрифугирования или фильтрования. В проходящем свете с длиной волны 450 нм живые бактерии светятся зеленым светом, а мертвые - оранжево-красным. Подсчет численности бактериальных клеток в ходе микроскопирования ведется одновременно по отдельным морфологическим признакам, что дает возможность охарактеризовать как состав сообщества, так и общую численность микроорганизмов (кл/см³) в исследуемом объекте.

Люминесцентная микроскопия широко используется в медицинской микробиологии для диагностики возбудителей туберкулеза, дифтерии, гонореи, возвратного тифа и др.

Разработан ГОСТ Р 52415-2005 Молоко натуральное коровье - сырое. Люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов.

В настоящее время для исследований применяют следующие модели люминесцентных микроскопов, выпускаемых отечественной промышленностью: ЛЮМАМ 3-8, МЛД-2, ЕС БИМАМ Р—11, ЕС БИМАМ Р—13.

К главным недостаткам люминесцентной микроскопии относятся низкое разрешение при подсчете мелких бактериальных клеток (размером менее 1 мкм) и, следовательно, пропуск их большей части, большое напряжение зрения при подсчете мелких клеток, а также затемненные условия микроскопирования.

10.4. Метод проточной цитометрии

Проточная цитометрия (ПЦ) является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов. Принцип метода ПЦ основан на регистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки. Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцентными красителями, под давлением подается в проточную ячейку, где за счет гидродинамического фокусирования клетки, находясь в ламинарном потоке, выстраиваются в цепочку друг за другом. В момент пересечения клеткой лазерного луча высокочувствительные детекторы регистрируют интенсивность ее флюоресценции и рассеянное лазерное излучение. В ходе анализа учитывается также уровень флюоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлюоресценция). Полученный сигнал подается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков или гистограмм. Аппарат для проведения ПЦ позволяет определять до 5-10 различных параметров клетки, таких как размер, активность ферментов, содержание белков, ДНК, липидов, антигенных веществ.

Метод ПЦ находит самое различное применение, начиная от простого подсчета клеток и определения их жизнеспособности и заканчивая более сложными исследованиями в иммунологии, онкологии, цитологии, гематологии, фармакологии.

10.5. Определение количества микроорганизмов методом мембранного фильтрования

Сущность метода состоит в том, что определенный объем исследуемой пробы (питьевой воды, стойких безалкогольных напитков, пастеризованного пива) фильтруют через мембранные фильтры с размером пор от 0,15 до 0,25 мкм (см. раздел 10.3). Осевшие на фильтре микроорганизмы окрашивают и подсчитывают под микроскопом с применением окулярного сетчатого микрометра в нескольких полях зрения на определенной площади препарата. Подсчет численности бактериальных клеток в ходе микроскопирования ведется одновременно по отдельным морфологическим группам, что дает возможность охарактеризовать как состав микробного сообщества, так и (после суммирования данных) общую численность микроорганизмов в исследуемом объекте.

10.6. Определение количества микроорганизмов методом подсчета колоний (чашечный метод)

Цель работы: определить количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов в пищевом продукте.

Чашечный метод широко применяется для определения численности жизнеспособных клеток микроорганизмов в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В основе метода лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Однако необходимо учитывать, что для микроорганизмов, образующих цепочки или другие скопления клеток, результаты всегда несколько занижены. Поэтому при использовании чашечного метода результат выражают не числом клеток в единице массы или объема, а количеством колониеобразующих единиц (КОЕ). В отличие от прямого подсчета клеток под микроскопом этот метод дает возможность определить только число жизнеспособных клеток.

Определение чашечным методом числа микроорганизмов включает следующие этапы: отбор проб и подготовку их к анализу, приготовление разведений микробной суспензии, посев в чашки Петри на плотную среду, инкубацию посевов при оптимальной температуре, подсчет выросших колоний и обработку результатов.

В качестве питательной среды для учета бактерий используют мясопептонный агар, на котором могут расти только сапрофитные аэробные и факультативно анаэробные бактерии, но неспособны расти строго анаэробные. Дрожжи и мицелиальные грибы обычно выращивают на сусло-агаре.

10.7. Учет живых микроорганизмов методом предельных разведений

Метод предельных разведений применяется для установления количества микроорганизмов отдельных физиологических групп (молочнокислых, уксуснокислых бактерий, кишечных палочек и др.). Сущность метода состоит в том, что делается ряд десятикратных разведений исследуемого материала. Количество разведений готовится в зависимости от предполагаемого содержания бактерий в исследуемом объекте таким образом, чтобы в последних разведениях данных бактерий не было. Материалом, взятым из приготовленных разведений, засевают определенное число пробирок с питательной средой. После инкубации при оптимальной температуре визуально устанавливают, в каком наименьшем количестве исследуемого материала еще находятся представители данной группы микроорганизмов.

Например, при определении количества молочнокислых бактерий в кисломолочном продукте готовят ряд его последовательных разведений от 10^-1 до 10^-10. Из каждого разведения в три пробирки со стерилизованным обезжиренным молоком параллельно засевают по 1 см суспензий. Пробирки выдерживают в термостате при оптимальной температуре в течение 18-24 ч, после чего отмечают, в каких пробирках образовался сгусток за счет накопления молочнокислыми бактериями молочной кислоты. В параллельных посевах может получиться не один и тот же результат вследствие неравномерного распределения клеток в исследуемой пробе. В дальнейшем титр определяется с помощью специальных расчетных таблиц.

Если для определения числа живых микроорганизмов используют бульонную питательную среду, то после инкубации пробирки, в которых размножились микроорганизмы, окажутся мутными, а пробирки, засеянные разведениями, в которых уже не содержалось жизнеспособных микроорганизмов, останутся прозрачными. Доля пробирок, оказавшихся мутными при посеве культуры данного разведения, зависит от числа живых клеток в неразведенной культуре. По числу мутных пробирок в группах, засеянных суспензиями трех последовательных разведений, определяют с помощью соответствующих таблиц наиболее вероятное число (НВЧ) клеток микроорганизмов.

10.8. Нефелометрический метод определения биомассы

Нефелометрический (турбидиметрический) метод определения биомассы нашел широкое применение в лабораторных микробиологических исследованиях, поскольку позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в суспензии микроорганизмов.

Нефелометрический метод основан на рассеивании пучка света взвешенными в жидкой фазе частицами. Данный метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и при этом не происходит образования мицелия, пленок и других скоплений. Питательная среда, в которой культивируют микроорганизмы, должна быть оптически прозрачной.

Светорассеяние, вызываемое микроорганизмами, выросшими в питательном бульоне, наиболее удобно измерять с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК) или спектрофотометра (СФ) при длине волны от 540 до 650 нм, при которой поглощение света данной суспензией является минимальным.

Зависимость между интенсивностью падающего света (l₀) и прошедшего света I (т.е. света, не рассеянного культурой) при малых концентрациях бактерий подчиняется закону Ламберта-Бера:

l= lо 10^-ε/с,

где ε - коэффициент экстинкции, l - толщина слоя суспензии, с -концентрация бактерий. Из этого соотношения следует:

lg (lо/l) = εlс.

График зависимости lg (lо/l) от с (концентрации бактерий) имеет вид прямой, угол наклона которой определяется произведением εl. Таким образом, изменение оптической плотности, вызываемое изменением концентрации бактерий на одну единицу, зависит от толщины слоя суспензии l и свойств суспензии, характеризуемых коэффициентом ε.

При высоких концентрациях бактерий закон Ламберта-Бера теряет свою силу.

Для определения числа бактерий нефелометрическим методом строят калибровочные кривые зависимости между величиной светорассеяния и числом клеток (или сухой биомассы в единице объема среды). Для построения калибровочной кривой измеряют на ФЭК или СФ величину светорассеяния суспензии с различным содержанием клеток и в каждой из них определяют количество клеток и биомассы. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на оси ординат показания ФЭК, а на оси абсцисс - количество клеток, содержащееся в 1 см³ суспензии, или биомассу в 1 дм³ культуральной среды. Для каждого микроорганизма необходимо строить свою калибровочную кривую.

Контрольные вопросы

1. Какие методы определения количества микроорганизмов в различных объектах вам известны?

2. С какой целью готовят серию разведений исследуемого объекта для определения общего количества микроорганизмов при использовании чашечного метода? Что такое КОЕ?

3. Все ли бактерии, находящиеся в исследуемом продукте, учитываются чашечным методом?

4. Какие питательные среды используют для определения в продукте количества бактерий и грибов (дрожжей и плесеней)?

5. Каковы достоинства и недостатки флуоресцентного метода подсчета микроорганизмов?

6. В чем заключается сущность метода проточной цитометрии?

7. На чем основан нефелометрический метод определения количества бактерий или биомассы в суспензии?