ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I - Л. В. Красникова - 2016

1. МИКРОСКОПИЯ

Изучение клеток микроорганизмов, не видимых невооруженным глазом, возможно только при помощи микроскопов (от греч. micros - малый, skopeo - смотрю). Эти приборы позволяют получать изображение исследуемых объектов, увеличенное в сотни раз (световые микроскопы) и в десятки - сотни тысяч раз (электронные микроскопы).

1.1. Устройство светового микроскопа

Цель работы: ознакомить студентов с устройством светового микроскопа, его характеристиками и правилами работы с ним.

Микроскоп называется световым, так как он обеспечивает возможность изучать объект в проходящем свете. Основными элементами современных световых микроскопов являются механическая и оптическая части (рис. 1.1).

Рис. 1.1. Устройство микроскопа: 1 - основание; 2 - тубусодержатель; 3 - тубус; 4 - окуляр; 5 - револьверная насадка; 6 - объектив; 7 - предметный столик; 8 - клеммы, прижимающие препарат; 9 - конденсор; 10 - кронштейн конденсора; 11 - рукоятка перемещения конденсора; 12 - откидная линза; 13 - зеркало; 14 - макровинт; 15 - микровинт; 16 - коробка с механизмом микрометрической фокусировки; 17 - головка для крепления тубуса и револьверной насадки; 18 - винт для крепления головки

К механической части относятся штатив, тубус, револьверная насадка, коробка микромеханизма, предметный столик, макрометрический и микрометрический винты.

Штатив состоит из двух частей - основания и тубусодержателя (колонки). Основание микроскопа прямоугольной формы, имеет снизу четыре опорные площадки, что обеспечивает устойчивое положение микроскопа на поверхности рабочего стола.

Тубусодержатель соединяется с основанием и может перемещаться в вертикальной плоскости при помощи макро- и микрометрического винтов. При вращении винтов по часовой стрелке тубусодержатель опускается, при вращении против часовой стрелки - поднимается от препарата. В верхней части тубусодержателя укреплена головка с гнездом для монокулярной (или бинокулярной) насадки и направляющей для револьверной насадки. Головка крепится винтом.

Тубус - это труба микроскопа, позволяющая поддерживать определенное расстояние между основными оптическими деталями - окуляром и объективом. Вверху в тубус вставляется окуляр. Современные модели микроскопов имеют наклонный тубус.

Револьверная насадка представляет собой вогнутый диск с несколькими гнездами, в которые ввинчиваются 3-4 объектива. Вращая револьверную насадку, можно под отверстие тубуса быстро установить любой объектив в рабочее положение.

Коробка микромеханизма несет с одной стороны направляющую для кронштейна конденсора, а с другой - направляющую для тубусодержателя. Внутри коробки находится механизм фокусировки микроскопа, представляющий собой систему зубчатых колес.

Предметный столик служит для размещения на нем препарата или другого объекта исследования. Столик может быть квадратным или круглым, подвижным или неподвижным. Подвижный столик перемещается в горизонтальной плоскости при помощи двух боковых винтов, что позволяет рассматривать препарат в разных полях зрения. На неподвижном столике для обследования объекта в разных полях зрения препарат перемещают рукой. Снизу в центре предметного столика имеется отверстие для освещения лучами света, направляемыми от осветителя. На столике имеются две пружинные клеммы, предназначенные для закрепления препарата. Некоторые системы микроскопов снабжены препаратоводителем, необходимым при исследовании поверхности препарата или при подсчете клеток. Препаратоводитель позволяет производить передвижение препарата в двух взаимноперпендикулярных направлениях. На препаратоводителе имеется система линеек - нониусов, с помощью которых можно сообщить координаты любой точке исследуемого объекта.

Макрометрический винт (макровинт) служит для предварительной ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта. При вращении макровинта по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, при вращении против часовой стрелки - поднимается.

Микрометрический винт (микровинт) используют для точной установки изображения объекта. Микрометрический винт является одной из наиболее легко повреждаемых частей микроскопа, поэтому с ним надо обращаться осторожно: во избежание самопроизвольного опускания тубуса не вращать винт с целью грубой установки изображения. При полном повороте микровинта тубус передвигается на 0,1 мм.

Оптическая часть микроскопа состоит из основных оптических деталей (объектива и окуляра) и вспомогательной осветительной системы (зеркала и конденсора).

Объективы (от лат. objektum - предмет) - наиболее важная, ценная и хрупкая часть микроскопа. Они представляют собой систему линз, заключенных в металлическую оправу, на которой указаны степень увеличения и числовая апертура. Наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату, называется фронтальной. Именно она обеспечивает увеличение. Остальные линзы называются коррекционными и служат для устранения недостатков оптического изображения, возникающих при рассмотрении исследуемого объекта.

Объективы бывают сухие и иммерсионные, или погружные. Сухим называется объектив, у которого между фронтальной линзой и рассматриваемым объектом находится воздух. Сухие объективы обычно имеют большое фокусное расстояние и увеличение 8х или 40х. Иммерсионным (погружным) называют объектив, у которого между фронтальной линзой и препаратом находится специальная жидкая среда. Вследствие разницы между показателями преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей преломляется и не попадает в глаз наблюдателя. В результате этого изображение получается нечетким, более мелкие структуры остаются невидимыми. Избежать рассеивания светового потока можно путем заполнения пространства между препаратом и фронтальной линзой объектива веществом, показатель преломления которого близок к коэффициенту преломления стекла. К таким веществам относятся глицерин (1,47), кедровое масло (1,51), касторовое (1,49), льняное (1,49), гвоздичное (1,53), анисовое (1,55) и др. Иммерсионные объективы имеют на оправе обозначения: I - immersion (иммерсия), HI - Homogen immersion (однородная иммерсия), OI - oil immersion и МИ - масляная иммерсия. В настоящее время в качестве иммерсионной жидкости чаще используют синтетические продукты, соответствующие по оптическим свойствам кедровому маслу.

Объективы различают по их увеличению. Величина увеличения объективов обозначена на их оправе (8х, 40х, 60х, 90х). Кроме того, каждый объектив характеризуется определенной величиной рабочего расстояния. Для иммерсионного объектива это расстояние соответственно составляет 0,12 мм, для сухих объективов с увеличением 8х и 40х - 13,8 и 0,6 мм.

Окуляр (от лат. okularis - глазной) состоит из двух линз - глазной (верхней) и полевой (нижней), заключенных в металлическую оправу. Окуляр служит для увеличения изображения, которое дает объектив. Увеличение окуляра обозначено на его оправе. Существуют окуляры с рабочим увеличением от 4х до 15х.

При длительной работе с микроскопом следует пользоваться бинокулярной насадкой. Корпуса насадки могут раздвигаться в пределах 55-75 мм в зависимости от расстояния между глазами наблюдателя. Бинокулярные насадки часто имеют собственное увеличение (около 1,5х) и коррекционные линзы.

Конденсор (от лат. condenso - уплотняю, сгущаю) состоит из 2-3 короткофокусных линз. Он собирает лучи, идущие от зеркала, и направляет их на объект. При помощи рукоятки, расположенной под предметным столиком, конденсор может перемещаться в вертикальной плоскости, что приводит к увеличению освещенности поля зрения при поднятом конденсоре и уменьшению его при опущенном конденсоре. Для регулировки интенсивности освещения в конденсоре имеется ирисовая (лепестковая) диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок. При полностью открытой диафрагме рекомендуется рассматривать окрашенные препараты, при уменьшенном отверстии диафрагмы - неокрашенные. Под конденсором расположена откидная линза в оправе, используемая при работе с объективами малого увеличения, например, 8х или 9х.

Зеркало имеет две отражающие поверхности - плоскую и вогнутую. Оно закреплено на шарнирах в основании штатива, и его можно легко поворачивать. При искусственном освещении рекомендуется пользоваться вогнутой стороной зеркала, при естественном - плоской.

Осветитель выполняет функцию искусственного источника света. Он состоит из низковольтной лампы накаливания, закрепляющейся на штативе, и понижающего трансформатора. На корпусе трансформатора имеется рукоятка реостата, регулирующего накал лампы, и тумблер для включения осветителя.

Во многих современных микроскопах осветитель вмонтирован в основание.

1.2. Основные характеристики светового микроскопа

Числовая апертура А (от лат. aperture - отверстие) объектива характеризует его светособирательную способность и определяется по формуле

А = n sin 1/2 α,

где n - показатель преломления светового луча, проходящего через предметное стекло в среду между фронтальной линзой объектива и предметным стеклом; α - угол, одна сторона которого совпадает с оптической осью, а другая образована линией, соединяющей точку выхода эффективных лучей из объектива с границей действующего отверстия объектива; 1/2 α- половинный угол входного отверстия объектива.

Важно, чтобы значение величины n было максимальным. Повысить его можно введением в пространство между фронтальной линзой объектива и предметным стеклом вещества с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла, как это сказано выше. Не менее важно также, чтобы значение величины sin V а было максимальным. Предел повышения этого значения зависит от степени кривизны фронтальной линзы иммерсионного объектива и числовой апертуры конденсора. Следует помнить, что повысить величину sin 1/2 α при использовании иммерсионных объективов можно максимальным поднятием конденсора, что определяется его светособирательной функцией. Если конденсор опущен, то функция, по существу, нарушена.

Числовая апертура и увеличение объектива обозначены на его оправе: 8х0,2; 40x0,65; 90 х1,25.

Увеличительная способность микроскопа (D) определяется произведением увеличения окуляра (K) на увеличение объектива (V):

D = KV.

Теоретически микроскоп может дать увеличение х2000 раз и более. Однако следует различать полезное и бесполезное увеличение микроскопа. Увеличение, которое дает возможность рассматривать объект под предельным углом зрения, и есть полезное увеличение. Пределы полезного увеличения в обычных световых микроскопах достигают 1400. При превышении границ полезного увеличения возникают дифракция и другие явления, обусловленные волновой природой света. В частности, у объектива с увеличением 40х и числовой апертурой 0,65 полезное увеличение составляет 325-650. Такое увеличение позволяет различить все структуры, разрешаемые данным объективом. Поэтому для получения разрешения в пределах полезного при работе с объективом 40х следует брать окуляр 15х. Применение более сильных окуляров не даст возможности выявить более тонкие детали.

Если объектив имеет увеличение 90х (числовая апертура А = 1,25), то полезное увеличение для него равно 1250. Следовательно, и в данном случае не следует брать окуляры с увеличением более 15х, чтобы не выходить за пределы полезного увеличения.

Разрешающая способность микроскопа. Если увеличительная способность микроскопа зависит от объектива и окуляра, то разрешающая способность определяется, в основном, объективом и конденсором. Разрешающую способность рассчитывают по формуле

d = λ / 2А,

где λ - длина волны света, воспринимаемая человеческим глазом (0,4-0,7 мкм, средняя - 0,55 мкм); А - числовая апертура объектива.

Максимальная разрешающая способность светового микроскопа составляет 0,2 мкм. Разрешающая способность микроскопа тем лучше, чем меньше абсолютная величина d.

1.3. Правила работы с микроскопом

1. Микроскоп берут одной рукой за колонку штатива, а другой поддерживают за основание. Брать и поднимать микроскоп за другие детали категорически запрещается.

2. На рабочем столе микроскоп помещают колонкой к себе. Перед началом работы следует осторожно удалить пыль с оптических частей микроскопа мягкой сухой тканью, не касаясь пальцами линз.

3. С помощью револьверной насадки устанавливают нужный объектив. Характерный щелчок фиксатора внутри револьвера свидетельствует о центрированном положении объектива. Необходимо помнить, что, чем меньше увеличение объектива, тем больше фокусное расстояние. При работе с объективом 8х расстояние между препаратом и объективом около 9 мм, с объективом 40х оно составляет 0,6 мм, и с объективом 90х - около 0, 15 мм.

4. На предметный столик помещают предметное стекло и закрепляют его клеммами.

5. Тубус микроскопа опускают вниз с помощью макрометрического винта осторожно, наблюдая за объективом сбоку, и приближают к препарату (не касаясь его) на расстояние, меньшее рабочего. Затем, глядя в окуляр, медленным вращением макровинта поднимают тубус до тех пор, пока в поле зрения не появится изображение изучаемого предмета.

6. Вращением микрометрического винта объектив фокусируют таким образом, чтобы изображение предмета было четким.

7. При работе с иммерсионным объективом на предметное стекло наносят каплю кедрового масла и, глядя сбоку на объектив, макрометрическим винтом осторожно опускают тубус так, чтобы фронтальная линза объектива погрузилась в масло. Затем, глядя в окуляр, медленным движением макровинта поднимают тубус до тех пор, пока не появится изображение. Для точной фокусировки пользуются микрометрическим винтом, который вращают в пределах одного оборота.

Внимание! Запрещается искать изображение препарата с помощью микрометрического винта.

8. Препарат рассматривают в нескольких полях зрения, передвигая предметный столик при помощи боковых винтов, или перемещают его рукой на предметном столике. Находят наиболее подходящее поле зрения на участке препарата, на котором микроорганизмы видны отчетливо, в достаточном для просмотра количестве, и зарисовывают микроскопическую картину.

9. При смене объективов следует регулировать интенсивность освещения рассматриваемого объекта. Желаемую степень освещения получают, опуская или поднимая конденсор.

10. По окончании работы поднимают тубус, снимают препарат с предметного столика, удаляют масло с фронтальной линзы иммерсионного объектива фильтровальной бумагой, смоченной бензином, устанавливают при помощи револьверной насадки объектив с увеличением 8х, кладут на предметный столик кусочек чистой марли и опускают тубус.

1.4. Микроскопия в темном поле

Микроскопия в темном поле позволяет увеличить разрешающую способность объектива примерно в 10 раз и рассмотреть объекты, размеры которых находятся за пределами обычного микроскопа. Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми лучами света, которые не попадают в объектив и остаются невидимыми для глаза (явление Тиндаля). Поэтому поле зрения выглядит совершенно черным. Если препарат содержит какие-либо частицы, например, микроорганизмы, то косые лучи, направленные под определенным углом, вследствие дифракции отражаются от их поверхности и настолько отклоняются от своего начального направления, что попадают в объектив. Поскольку лучи света идут именно от объекта, то наблюдатель видит на черном фоне характерное светящееся изображение контуров микробных клеток или других частиц. Темное поле зрения достигается применением специального конденсора, которым заменяют обычный конденсор светового микроскопа. Однако эффект темного поля может быть достигнут лишь в том случае, если апертура конденсора превышает апертуру объектива на 0,2-0,4 единицы.

Темнопольную микроскопию используют для изучения живых клеток микроорганизмов. Она применяется для наблюдения за подвижностью микробов, обнаружения возбудителей некоторых болезней (лептоспироза). Однако к темном поле зрения нельзя хорошо изучить форму и внутреннее строение микробной клетки.

При рассмотрении дрожжевых клеток цитоплазма опалесцирует слабо и равномерно, на ее фоне отчетливо выделяются черные вакуоли, сильно блестящие гранулы липосом. Протопласт отмирающих клеток имеет молочно-белую окраску.

1.5. Фазово-контрастная микроскопия

Фазово-контрастная микроскопия дает возможность рассматривать живые объекты без окрашивания и фиксирования. Глаз человека реагирует на изменения длины световой волны (цвет) и ее амплитуды (интенсивность, контрастность), но не воспринимает различий по фазе. Метод фазово-контрастной микроскопии разработан для наблюдения за прозрачными объектами, которые пропускают лучи одинаковой длины и аплитуды, но смещают их фазу. Величина смещения зависит от толщины и показателя преломления структур. С помощью фазово-контрастного устройства фазовые изменения световых волн, проходящих через прозрачные объекты, превращаются в амплитудные, благодаря чему детали рассматриваемых объектов становятся хорошо видимыми глазом и контрастными.

Для проведения исследований в дополнение к световому микроскопу следует иметь фазово-контрастное устройство. Наиболее широко применяется модель КФ-4, состоящая из вспомогательного микроскопа, специальных фазовых объективов и конденсора с набором кольцевых диафрагм, каждая из которых соответствует фазовой пластинке определенного объектива.

Вспомогательный микроскоп устанавливают, заменяя окуляр обычного микроскопа. Для получения фазового контраста в объектив вводится сециальная фазовая пластинка, которая представляет собой тонкий диск с напылением из солей редких металлов на одну из внутренних линз объектива. Она изменяет фазу проходящей световой волны на 1/4 λ, что приводит к превращению фазовых различий в амплитудные. На оправе фазовых объективов обозначены индексы: Ф10, Ф20, Ф40 и Ф90. Кольцевые диафрагмы установлены в револьверном диске под конденсором и поворотом диска могут быстро меняться. Кольцевая диафрагма пропускает через конденсор в плоскость препарата лишь кольцо света. Эффект фазового контраста получают путем точного совмещения кольца фазовой пластинки с проекцией кольцевой диафрагмы.

1.6. Люминесцентная микроскопия

Применение люминесцентной микроскопии основано на свойстве некоторых биологических объектов светиться при их облучении невидимыми для человеческого глаза коротковолновыми лучами (сине-фиолетовыми с длиной волны около 460 нм или ультрафиолетовыми с длиной волны 300-400 нм). Такое явление объясняется тем, что часть энергии падающего света поглощается и освещаемый объект испускает лучи, имеющие большую длину волны, чем лучи возбуждающего света. При этом клетки светятся желто-зеленым или оранжевым светом (флуоресцируют). Это собственная или первичная люминесценция.

Первичным свечением обладают клетки растений и водорослей благодаря наличию хлорофилла, а также некоторые бактерии, вырабатывающие пигмент. Большинство клеток микроорганизмов обладает слабой первичной люминесценцией.

Вторичная (или наведенная) люминесценция объектов, не обладающих собственной люминесценцией, достигается их обработкой специальными красителями - флуорохромами. Наиболее широко используются флуорохромы акридиновой и тиазоловой групп (акридин оранжевый и желтый, аурамин, уранин, родамин, тиофлавин, примулин, флуоресцин и др.). В частности, акридин оранжевый окрашивает цитоплазму в зелено-желтый, метахроматин - в ярко-красный, вакуоли - в розовый, ядро - в светло-зеленый цвет.

Люминесцентная микроскопия осуществляется в затемненной комнате с помощью специального люминесцентного микроскопа, например, МЛ-2.

В качестве источника ультрафиолетового излучения в люминесцентных микроскопах используются специальные кварцевые лампы. Прежде чем попасть на объект, лучи лампы проходят через ряд светофильтров, пропускающих только определенную часть ультрафиолетового спектра с λ = 360-380 нм.

Более доступным способом возбудителя люминесценции является использование коротковолновой части видимого света - синефиолетовых лучей с λ = 460 нм. В этом случае наблюдения можно проводить не только в специальном люминесцентном микроскопе, но и с помощью обычного микроскопа, установив на пути лучей синий стеклянный или жидкий светофильтр. Излишние синие лучи убирают желтым светофильтром, который помещают на окуляр микроскопа. В результате в препарате на черном фоне видны люминесцирующие объекты.

Люминесцентная микроскопия позволяет наблюдать морфологические особенности объектов, которые при обычной микроскопии лежат за пределами видимости. Кроме того, она дает возможность дифференциации вида микробов по характеру свечения, изучения изменения структур при различных физиологических состояниях клетки. Этот метод позволяет изучать антигенную структуру бактерий и обнаруживать возбудителей инфекционных заболеваний путем применения меченных люминесцентными красками иммунных сывороток.

1.7. Электронная микроскопия

В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток движущихся электронов, что позволяет увеличить разрешающую способность прибора в 100 раз и более. Высокая разрешающая способность современных электронных микроскопов дает возможность наблюдать и изучать объекты, которые невидимы в световом микроскопе: вирусы, бактериофаги, микоплазмы, тонкое строение клеток прокариот и эукариот, их макро- и микроструктурные элементы.

Электронный микроскоп состоит из нескольких сложных узлов:

1. Колонна, в которой смонтированы электронная пушка, устройства, фокусирующие пучок электронов, конденсорная линза, камера объекта (предметный столик, объективная, промежуточная и проекционная линзы); флюоресцирующий экран, фотокамера.

2. Вакуумная установка, позволяющая создавать в колонне высокий вакуум.

3. Пульт управления.

4. Установка для электропитания, размещенная в металлическом шкафу за колонной.

5. Вспомогательные устройства.

Осветительная система электронного микроскопа состоит из электронной пушки и конденсорной линзы. В качестве линз, фокусирующих пучок электронов, используется электромагнитное поле (стеклянные линзы употреблять нельзя, так как стекло непроницаемо для электронов). Воздух препятствует движению электронов, поэтому внутри микроскопа необходимо поддерживать вакуум.

Техника подготовки препаратов для электронной микроскопии существенно отличается от той, которая используется для рассмотрения в световом микроскопе. Препараты для просматривания в электронном микроскопе готовят на очень тонкой, проницаемой для электронов подложке. В качестве подложки применяют пленки из коллодия, кварца или других материалов толщиной около 1 мкм. В связи с тем, что пленки очень тонкие и непрочные, их помещают на специальные металлические сетки с мелкими ячейками. Общая толщина препарата и подложки должна быть не более 0,25 мкм. С целью повышения контрастности изучаемых препаратов их подвергают дополнительной обработке в условиях глубокого вакуума путем напыления на них чрезвычайно тонкого слоя хрома, золота, платины или палладия, или используют различные контрастирующие вещества (уранилацетат, уранилнитрат, фосфорновольфрамовую кислоту). Рассматриваемый объект помещают на предметный столик, находящийся между конденсором и объективной линзой. Проходя через исследуемый объект, пучок электронов рассеивается и фокусируется в электромагнитном преломляющем поле объективной линзы. Получается первое увеличенное действительное изображение объекта (в 40-50 тыс. раз), наблюдаемое через смотровое стекло. Затем поток электронов попадает в электромагнитное поле проекционной линзы, которая конденсирует пучок проходящих электронов и фокусирует их на флюоресцирующем экране, давая окончательное увеличенное изображение объекта в 200-300 тыс. раз.

Под флюоресцирующим экраном находится фотокамера. Приподнимая специальной рукояткой экран, пропускают пучок электронов на фотопластинку и фотографируют изображение объекта.

Контрольные вопросы

1. Каковы основные правила работы в микробиологической лаборатории?

2. Назовите основные элементы механической части микроскопа.

3. Назовите основные элементы оптической части микроскопа.

4. Что такое числовая апертура микроскопа?

5. Чем отличаются сухие объективы от иммерсионных?

6. Каково назначение макро- и микрометрического винтов?

7. Для чего нужна револьверная насадка?

8. Как определить увеличительную способность микроскопа?

9. Как регулировать степень освещенности препарата?

10. Назовите основные характеристики светового микросокпа.

11. В чем заключается сущность микроскопии в темном поле?

12. Поясните принцип работы фазово-контрастного микроскопа.

13. Объясните принцип работы люминесцентного микроскопа.

14. Каковы особенности работы с электронным микроскопом?