ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I - Л. В. Красникова - 2016

8. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И ФИЗИОЛОГОБИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ БАКТЕРИЙ

Цель работы: рассмотреть культуральные и физиологобиохимические признаки бактерий, выращенных на различных питательных средах.

8.1. Культуральные признаки бактерий

Культуральные признаки бактерий выявляют по особенностям их роста на различных жидких и плотных питательных средах. Каждый вид микробов образует на плотных средах колонии определенного размера, соответствующей формы.

Колонии характеризуют по размеру, форме, профилю, контуру края, поверхности, цвету, структуре и консистенции.

Размер колонии определяется ее диаметром, в зависимости от которого различают точечные колонии - диаметр менее 1 мм, мелкие - диаметр 1-2 мм, средние - от 2 до 9 мм, крупные - 10 мм и более.

Форма колонии бывает округлой, неправильной, амебовидной, розетковидной, концентрической и т. д. (рис. 8.1).

Рис. 8.1. Формы колоний микроорганизмов: а - круглая; б - круглая с фестончатым краем; в - круглая с валиком по краю; г, д - ризоидные; е - круглая с ризоидным краем; ж - амебовидная; з - мицелиальная; и - складчатая; к - неправильная; л - концентрическая; м - сложная

Профиль колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется профиль колонии при визуальном изучении сверху и сбоку. Различают плоские, выпуклые, кратерообразные, конусовидные, каплевидные колонии (рис. 8.2).

Рис. 8.2. Профиль колоний микроорганизмов: а - изогнутый; б - кратеровидный; в - бугристый; г - врастающий в агар; д - плоский; е - выпуклый; ж - каплевидный; з - конусовидный

Край колонии определяют при рассмотрении его через лупу или в микроскоп с увеличением 8х. Различают следующие контуры края колоний: ровный, волнистый, бахромчатый, зубчатый, фестончатый, лопастной, реснитчатый, ворсинчатый, ветвистый, ризоидный и др.

Поверхность бывает гладкой или шероховатой, сухой или влажной, бороздчатой, складчатой, морщинистой, бархатистой, бугристой, с концентрическими кругами или радиально исчерченная.

Оптические свойства: прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная, флуоресцирующая.

Цвет колонии определяется пигментом, который синтезируется данным видом микроорганизма. В зависимости от типа образуемого пигмента колонии микроорганизмов могут быть окрашены в красный, розовый, желтый, золотисто-оранжевый, желто-зеленый, синий, черный цвет.

Структура колонии бывает однородной, мелко- или крупнозернистой, мучнистой, пленчатой, врастающей в агар.

Консистенция может быть пастообразной, легко снимающейся петлей, вязкой или слизистой, прилипающей и тянущейся за петлей; плотной; волокнистой; тестообразной; сметанообразной; сухой, снимающейся с поверхности агара в виде упругой пленки; хрупкой, рассыпающейся при прикосновении петлей. Консистенцию колонии устанавливают, прикасаясь к ее поверхности петлей.

При посеве микроорганизмов штрихом отмечают интенсивность роста (обильный, умеренный, слабый), особенности штриха (затягивающий, ветвистый, бугристый), оптические свойства поверхности, цвет, консистенцию.

Для характеристики роста бактерий в жидких средах производят посевы культур в мясопептонный бульон или другую среду, обеспечивающую их хороший рост. Для описания роста используют 4-7-суточные культуры, выращенные в стационарных условиях. В первую очередь отмечают интенсивность роста (скудный, умеренный, обильный). Затем обращают внимание на помутнение среды (однородное, хлопьевидное, с шелковистой волнистостью), наличие пленки (толстая или тонкая, сухая или слизистая, гладкая или складчатая, кольцеобразная или сплошная). Если культура пигмента не образует, то цвет среды не изменяется, а осадок приобретает, как правило, серовато-белый или желтовато-коричневый цвет. Нередко рост микроорганизмов в жидкой среде сопровождается появлением запаха, выделением газа. Газообразование обнаруживается по появлению пузырьков или пены.

8.2. Физиолого-биохимические признаки бактерий

При изучении физиолого-биохимических признаков бактерий исследуют их отношение к кислороду, ферментативную активность, способность расщеплять различные углеводы с накоплением определенных продуктов метаболизма.

Отношение к кислороду воздуха. По отношению к кислороду воздуха микроорганизмы делят на облигатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Об отношении бактерий к кислороду судят по росту культуры при посеве ее уколом в столбик с питательным агаром. Аэробы развиваются в верхней части укола, анаэробы - в нижней части, а факультативные анаэробы - равномерно по всему уколу.

Среди биохимических свойств культуры наиболее важно определение их ферментативной активности.

Использование углеводов и спиртов культурами микроорганизмов определяют путем посева 0,1 — 0,2 см суспензии исследуемых клеток в пробирки с жидкой или полужидкой средой, содержащей углевод и индикатор. Для обнаружения образования газа при расщеплении углеводов в жидкую среду опускают поплавки. Набор сред с углеводами и индикатором называют «цветным» рядом Гисса. Название «цветной» ряд связано с тем, что под действием ферментов клеток одни сахара расщепляются с накоплением кислоты, или щелочи, за счет чего изменяется цвет индикатора и среды, другие сахара не расщепляются, и цвет среды не изменяется. Короткий ряд Гисса включает среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. В длинный ряд дополнительно вводят среды с арабинозой, ксилозой, рамнозой, галактозой, а также полисахариды (инулин, крахмал, декстрин) и спирты (глицерин, дульцит, инозит).

Засеянные пробирки помещают в термостат при оптимальной температуре. Результаты учитывают через 2 — 4 сут (для медленно растущих микроорганизмов — через 7 — 10 сут). Отмечают изменение цвета индикатора или отсутствие изменения цвета среды, а также появление или отсутствие газа в поплавке.

На основании полученных данных делают вывод, какие сахара ассимилирует исследуемая культура бактерий.

Протеолитическая активность. Микроорганизмы, обладающие протеолитической активностью, разжижают желатин, пептонизируют молоко. Для определения этого признака культуру исследуемых бактерий засевают уколом в пробирки с желатином и культивируют в течение 4-10 сут при комнатной температуре, отмечая при этом скорость разжижения и его характер: послойный, воронкообразный, пузырчатый и т. п. (рис. 8.3).

Рис. 8.3. Характер разжижения желатина протеазами исследуемых бактерий

Каталазная активность. Фермент каталазу образуют многие аэробные микроорганизмы. Для проведения исследования каплю 10 %-го раствора пероксида водорода наносят на колонию микроорганизма, выросшую в течение 24 ч на плотной среде в чашке Петри. Выделение кислорода в виде пузырьков газа свидетельствует о наличии в клетках бактерий каталазы.

Характер роста в молоке. Обезжиренное молоко разводят водой в соотношении 4:1, добавляют индикатор бромкрезоловый пурпурный (2 см³ 1,6 %-го спиртового раствора на 1 дм³ молока) или лакмус (10 ^см3 4 %-го раствора на 1 дм³ молока), разливают в пробирки емкостью 8-10 см и стерилизуют в автоклаве при 0,05 МПа в течение 20 мин. Пробирки с молоком засевают исследуемой культурой бактерий и культивируют 6-14 сут. при оптимальной температуре. Образование кислот микроорганизмами при расщеплении лактозы отмечают по изменению цвета индикатора. Если кислота накапливается в значительном количестве, то образуется сгусток. Бактерии, обладающие активными протеазами, расщепляют казеин, вызывая пептонизацию молока.

Образование индола. Некоторые микроорганизмы обладают способностью расщеплять аминокислоту триптофан с образованием индола, что также является диагностическим признаком при определении вида бактерий. Для определения индола применяют метод Мореля. Пробирки с 8-10 см стерильного мясопептонного бульона с добавлением 0,01 %-го триптофана (или без него) засевают исследуемой культурой бактерий. Под ватной пробкой укрепляют полоску фильтровальной бумаги, пропитанную щавелевой кислотой. Пробирки инкубируют при оптимальной температуре в течение 24 ч. При образовании индола нижняя часть полоски окрашивается в розовый цвет.

Образование аммиака. Аммонификация белковых веществ под влиянием ферментов микроорганизмов сопровождается выделением аммиака. Эту способность бактерий устанавливают путем засева исследуемой культуры в пробирки с мясопептонным бульоном, которые инкубируют в течение 2-3 сут. в термостате при температуре 37 °С. Образование аммиака определяют по изменению окраски полоски лакмусовой бумажки, укрепленной между пробкой и горлышком пробирки таким способом, чтобы полоска не касалась питательной среды. Выделение аммиака обозначается изменением цвета лакмусовой бумажки из красного в синий.

Образование сероводорода. При расщеплении микроорганизмами серосодержащих аминокислот (цистеин, метионин) образуется сероводород. Для определения образования сероводорода пробирки с мясопептонным бульоном засевают исследуемой культурой бактерий и под пробкой укрепляют полоску фильтровальной бумаги, пропитанную раствором ацетата свинца. Засеянные пробирки помещают в термостат при оптимальной температуре на 7-10 сут. Выделение сероводорода фиксируют по почернению полоски вследствие образования сернистого свинца.

На основании морфологических, культуральных и физиологобиохимических признаков выделенной культуры определяют ее видовую принадлежность, пользуясь определителем бактерий Берджи.

Исследования по идентификации бактерий оформляют в форме протокола (табл. 8.1).

В необходимых случаях проводят изучение других признаков, например, способность к восстановлению нитратов, образование оксидазы и т. д.

Таблица 8.1. Характеристика культуры по морфологическим, культуральным и физиолого-биохимическим признакам

Контрольные вопросы

1. Какие признаки используются при определении вида бактерий?

2. По каким признакам характеризуют колонии бактерий на плотной питательной среде?

3. Как характеризуется рост бактерий в жидкой среде?

4. Как выявляется протеолитическая активность бактерий?

5. Как определить способность бактерий сбраживать сахара?

6. Какие изменения могут наблюдаться при развитии бактерий в молоке и как их объяснить?

7. Какие признаки свидетельствуют об образовании бактериями аммиака, сероводорода, индола?