ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ II - Л. В. Красникова - 2016

ТЕМА 8. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРИ ПЕРЕРАБОТКЕ РЫБЫ

8.1. Микрофлора рыбы

Основная задача микробиологического контроля рыбы и продуктов из нее заключается в изучении видового состава и свойств бактерий, встречающихся на рыбе и рыбных продуктах, их влиянии на технологические процессы переработки рыбы, а также разработка эффективного санитарно-гигиенического контроля предприятий, анализ воды, оборудования, инвентаря, тары, личной гигиены сотрудников. Санитарно-микробиологический контроль рыбного производства подразделяется на основной (профилактический) и дополнительный.

Основной микробиологический контроль включает в себя исследование поступающего сырья, вспомогательных материалов, готовой продукции, а также санитарного состояния производства. Он проводится систематически, в сроки, определяемые нормативнотехническими документами производства и контролирующими организациями в порядке, предусмотренном законом.

Дополнительный микробиологический контроль производства проводится в случае стойкой повышенной обсемененности готового продукта микроорганизмами с целью обнаружения и устранения источника контаминации, а также, если предполагается наличие в продукте возбудителей пищевых токсикозов и токсикоинфекций. Микробиологический контроль осуществляет производственная лаборатория, а при её отсутствии - сторонние аттестованные организации.

Мясо рыб имеет рыхлую консистенцию, поскольку в нем меньше соединительных тканей, чем в мясе теплокровных животных. Это способствует распространению микроорганизмов в теле рыбы. Количественный и видовой состав микрофлоры свежевыловленной рыбы зависит от ее вида, характера водоема, сезона года, района, техники лова и других факторов.

Мышечный сок и мышечная ткань свежевыловленной здоровой рыбы считаются стерильными. Значительные количества бактерий обнаруживаются в покровной слизистой оболочке, на наружных жабрах и в желудочно-кишечном тракте. Количество бактерий на этих участках может составлять от 10³ до 10⁶ на 1 см².

Слизь, покрывающая поверхность рыбы, не только содержит микроорганизмы, но и служит благоприятной средой для их развития.

В теплых водах на поверхности рыбы присутствуют мезофильные микробы - различные виды бацилл, коринебактерий, микрококков. В покровной слизистой оболочке могут содержаться светящиеся бактерии, например, Photobacterium phosphoreum.

В умеренных и холодных водах доминируют психрофильные и психротрофные микроорганизмы. В речной и морской водах количество психрофилов на 1 см² кожи рыбы колеблется от 10² до 10⁴. Они представлены, главным образом, бактериями родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Flavobacterium. Встречаются также микрококки, коринебактерии, реже спорообразующие палочки рода Bacillus, а также дрожжи и актиномицеты. Осетровые рыбы иногда бывают контаминированы палочкой ботулизма - С. botulinum. В прибрежных морских водах и во внутренних водных бассейнах поверхность рыбы может быть контаминирована бактериями из семейства Enterobacteriaceae родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Proteus.

В связи с ухудшением экологической обстановки в разных странах мира, сбросом бытовых и промышленных сточных вод в природные водоемы резко возросла опасность заражения рыб патогенными бактериями - шигеллами и сальмонеллами, что требует особенного внимания к санитарной обработке рыбы и изменению ее микрофлоры при хранении. Пресноводные рыбы могут длительное время сохранять сальмонеллы в своем организме. Массовая эндогенная контаминация рыб сальмонеллами видов S. enteritidis или S. typhimurium вызывает у них псевдомембранозные воспаления кишечника.

Энтеропатогенные штаммы стафилококков выделяются обычно во время переработки рыбы, так как эти микроорганизмы составляют около 40 % микрофлоры рук и носоглотки обслуживающего персонала. Чтобы предотвратить обсеменение рыбы стафилококками, температура хранения рыбы должна быть не выше 10 °С.

На морской рыбе иногда встречается галофильный вибрион - Vibrio parahaemolyticus - возбудитель гастроэнтеритов и отравлений по типу токсикоинфекций.

В жабрах и кишечнике рыб всегда присутствует большое количество разнообразных микроорганизмов. В 1 г содержимого кишечника свежеуснувшей рыбы насчитывается до 10⁵ - 10⁸клеток микроорганизмов. Это различные гнилостные бактерии, в том числе спорообразующие: С. sporogenes, C. perfringens, C. bifermentans.

На наружных жабрах и слизистой оболочке рта свежевыловленной рыбы могут также присутствовать дрожжи, но в дальнейшем при хранении они подавляются бактериями. Выделенные дрожжи были отнесены к родам Debaryomyces, Torulopsis, Candida, Rhodotorula, Pichia, Cryptococcus.

Микробиологическое исследование свежей рыбы начинают с приготовления препаратов-отпечатков (бактериоскопический метод), а затем проводят бактериологический анализ.

Свежеуснувшая рыба быстро подвергается микробной порче, которая происходит тем быстрее, чем выше температура ее хранения и чем больше на рыбе микроорганизмов. На поверхности рыбы активно размножаются гнилостные аэробные бактерии, которые поглощают кислород и в результате создают условия для развития анаэробов, при этом процесс гниения смещается вовнутрь. Развитие гнилостной микрофлоры приводит к сдвигу рН в щелочную сторону, что способствует размножению многих других микроорганизмов. Поэтому после вылова рыбу следует быстро охладить. При резком понижении температуры тела рыбы размножение большинства микроорганизмов приостанавливается. Так, если при 18 °С количество бактерий через одни сутки возрастает до 108 - 109 в 1 г рыбы, то при температуре около 0 °С рост микроорганизмов задерживается на 24-48 ч, после чего на поверхности охлажденной рыбы и на жабрах начинается размножение психрофильных микроорганизмов. Главными возбудителями порчи рыбы являются бактерии рода Pseudomonas. Через 10 сут. доля псевдомонад возрастает до 50 % от общего количества, а через 18 сут. - до 96 %. Вызывая гнилостный распад белка, псевдомонады образуют значительные количества летучих соединений, в том числе триметиламин, обладающий неприятным запахом, а также газы - H₂S, NH₃. Псевдомонады характеризуются не только высокой скоростью роста, но и повышенной ферментативной активностью по отношению к белкам и липидам.

Для охлаждения рыбы часто используется лед в сочетании с хлоридом натрия, которые, в свою очередь, могут быть источниками обсеменения рыбы посторонними микроорганизмами.

Более длительное хранение обеспечивает замораживание рыбы. Если быстро подвергнуть замораживанию свежевыловленную рыбу, то вся микрофлора располагается на поверхности ее тела, тогда, как в толще мышц микроорганизмов еще нет. Хранение такой замороженной рыбы при температуре не выше минус 12-15 °С позволяет длительное время сохранять ее качество (несколько месяцев) и значительно снизить количество микроорганизмов.

В процессе замораживания и длительного холодильного хранения часть микроорганизмов отмирает, но некоторые из них сохраняют свою жизнеспособность, находясь в состоянии анабиоза. При этом, чем выше скорость замораживания и ниже температура хранения, тем большее количество микроорганизмов останется жизнеспособным.

На замороженной рыбе обнаруживают преимущественно различные микрококки, спорообразующие и неспорообразующие формы палочковидных бактерий, споры мицелиальных грибов. Допустимое содержание сапрофитных микроорганизмов на замороженной рыбе до 10⁵ КОЕ/г.

8.2. Бактериоскопическое исследование свежей рыбы

Отбор проб. Пробы для микробиологического исследования отбирают согласно нормативной документации от каждой партии (одного вида, сорта, наименования и др.). Количество единиц упаковки, подлежащих вскрытию, устанавливается действующими НТД производства (не менее 5 % или 5 единиц от общего количества в партии). Перед отбором пробы необходимо осмотреть всю партию, вскрыть отдельные единицы упаковки, дать органолептическую оценку продукта и затем отобрать пробу. Пробы для микробиологических анализов отбирают стерильным инструментом в стерильную посуду. Пробы мелкой рыбы, нерыбных объектов морского промысла, ястыков, молок и т. д. отбирают в количестве 3-10 шт. из разных мест исследуемой партии и составляют среднюю пробу. Средняя проба формируется путем измельчения, перемешивания и растирания отобранных образцов.

Навеску отбирают в количестве 1 г из средней пробы и постепенно добавляют к ней 9 см³ жидкости (изотонический раствор хлорида натрия), получая исходное разведение 10^-9. Взвесь хорошо перемешивают или взбалтывают и оставляют при комнатной температуре на 3-5 мин. Затем исследуют надосадочную жидкость. При необходимости готовят последующие разведения, используя каждый раз новую пипетку.

Крупную рыбу и крупные экземпляры нерыбных объектов морского промысла отбирают в количестве не более 3 шт. От каждого экземпляра из нескольких мест вырезают кусочки с кожей и мышцами, не затрагивая кишечник, площадью около 4 см², толщиной 4-5 мм и помещают в колбу для формирования средней пробы. Рыбу и объекты морского промысла после разделки и мойки отбирают и вырезают небольшими кусочками массой не более 300 г.

Каждый образец упаковывают отдельно в пергаментную бумагу, ставят дату, место взятия проб, вид рыбы, указывая причину и цель исследования, и отправляют в лабораторию.

Для скоропортящихся продуктов, к которым относятся рыба и рыбные продукты, интервал времени между отбором проб и микробиологическим анализом составляет не более 6 ч в диапазоне температур от 0 до +4 °С. Такое исследование проводят отдельно для поверхности рыбы и для её внутренних тканей.

К поверхности исследуемой рыбы прикладывают профламбированное предметное стекло и прижимают его в течение 1 мин. Стекло осторожно снимают, подсушивают, препарат фиксируют в пламени горелки и окрашивают по методу Грама. На препарат-отпечаток наносят каплю иммерсионного масла и просматривают его под микроскопом с иммерсионным объективом (увеличение 90х) не менее чем в тридцати полях зрения.

Из глубины мышц тоже готовят препарат-отпечаток. Для этого кожу посередине спины рыбы освобождают от чешуи и прижигают раскаленным скальпелем. Стерильными ножницами и пинцетом вырезают кусочек мяса рыбы на глубине 1,0-1,5 см общей площадью около 2 см². Вырезанным кусочком делают несколько отпечатков. На предметное стекло кусочек прикладывают на 1 мин разными гранями, после чего обрабатывают препарат вышеизложенным способом.

При микроскопировании подсчитывают отдельно число клеток бактерий (кокков и палочек) и дрожжей в каждом просмотренном поле зрения, результатом является среднее значение общего количества клеток по тридцати полям зрения. Отмечают также наличие или отсутствие в поле зрения следов распада мышечной ткани.

Результаты микроскопирования оценивают согласно данным, представленным в табл. 8.1.

Таблица 8.1. Оценка результатов бактериоскопического анализа рыбы

8.3. Бактериологическое исследование свежей, охлажденной и мороженой рыбы

Бактериологический метод включает в себя исследование рыбы на общую микробную обсемененность, содержание бактерий группы кишечной палочки, присутствие сальмонелл, бактерий группы протея, энтерококков.

При бактериологическом исследовании каждую пробу освобождают от жировой и соединительной тканей, погружают в спирт, затем вырезают стерильными ножницами из глубины различных мест кусочки размером 2,0 х 1,5 x 2,5 см. Все вырезанные кусочки измельчают стерильными ножницами. Для посева составляют средние пробы по 15 г.

Определение КМАФАнМ. При исследовании свежей рыбы готовят разведения пробы от 10^-1 до 10^-4.

Для посева 0,1 г продукта (разведение 10^-1) готовят первое десятикратное разведение взвеси: стерильной пипеткой набирают 1 см³ взвеси, переносят её в пробирку с 9 см³стерильного физиологического раствора (1 см³ полученного раствора содержит 0,1 г продукта).

Для посева 0,01 г продукта (разведение 10^-2) готовят второе десятикратное разведение: стерильной пипеткой перемешивают содержимое пробирки с первым разведением, набирают 1 см³ и переносят в пробирку с 9 см³ стерильного физиологического раствора (1 см³ полученного раствора содержит 0,01 г продукта).

Для посева 0,001 г продукта готовят третье десятикратное разведение (10^-3): стерильной пипеткой перемешивают содержимое пробирки со вторым разведением, набирают 1 см³ и переносят в пробирку с 9 см³ стерильного физиологического раствора (1 см³ полученного раствора содержит 0,001г продукта).

Для посева 0,0001 г продукта готовят четвертое десятикратное разведение (10^-4): стерильной пипеткой перемешивают содержимое пробирки с третьим разведением, набирают 1 см³ и переносят в пробирку с 9 см³ стерильного физиологического раствора (1 см³ полученного раствора содержит 0,0001г продукта).

В табл. 8.2 приведены показатели микробиологической безопасности рыбы.

Таблица 8.2. Микробиологические показатели рыбы свежей, охлажденной и мороженой

По 1 см³ каждого разведения засевают в чашки Петри с заранее маркированной крышкой и заливают 10 — 15 см³ расплавленным и остуженным до 40 — 45 °С мясопептонным агаром (МПА). Сразу после заливки агара содержимое чашек Петри тщательно перемешивают путем легкого покачивания для равномерного распределения посевного материала. После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в таком виде на 72 ч в термостат при температуре 30 °С.

По окончании культивирования подсчитывают количество колоний, выросших на чашках с МПА. При этом используют лупу с увеличением в 4-10 раз или специальный прибор для подсчета колоний. При большом числе колоний и их равномерном распределении в агаре на дно чашки Петри наносят четыре или более одинаковых секторов, подсчитывают число колоний в двух-трех секторах (но не менее чем на 1/3 поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки.

8.4. Микробиология соленой рыбы

Посол является наиболее распространенным способом консервирования рыбы. По чувствительности к хлориду натрия микроорганизмы условно подразделяют на три группы:

1. Галофобные. К этой группе относятся микроорганизмы, жизнедеятельность которых подавляется при концентрации хлорида натрия 5-6 %. Это, в первую очередь, большинство гнилостных бактерий, молочнокислые бактерии, кишечные палочки, некоторые патогенные бактерии родов Salmonella, Vibrio. При содержании в среде около 6 % хлорида натрия подавляется размножение бактерий родов Pseudomonas и Achromobacter, однако они сохраняют свою жизнеспособность.

2. Галотолерантные (факультативные галофилы). Эти микроорганизмы могут расти при концентрации соли от 6 до 15 %. Высокой устойчивостью к действию соли характеризуются стафилококки. Их размножение подавляется лишь при концентрации соли в среде 16-18 %. Значительной устойчивостью к хлориду натрия обладают плесневые грибы. В частности, рост Aspergillus niger подавляется при 17 %, Penicillium glaucum - при 19-20 % хлорида натрия.

3. Галофильные (облигатные галофилы). Для размножения этой группы микроорганизмов оптимальная концентрация соли находится в интервале 3-6 %. Они способны расти в концентрированных солевых растворах или непосредственно в самой соли. Предполагают, что повышенное осмотическое давление или пониженная активность воды в питательной среде стимулируют рост этих микроорганизмов. К этой группе относится Micrococcus roseus, который придает красно-розовую окраску соленой сельди.

В табл. 8.3 приведены значения концентрации хлорида натрия, при которых рост определенных микроорганизмов подавляется.

Таблица 8.3. Концентрация хлорида натрия, ингибирующая рост разных видов микроорганизмов

Консервирующее действие соли зависит от ее концентрации, температуры среды, рН среды, присутствия в среде консервантов.

Различают следующие способы посола:

✵ теплый, охлажденный и холодный;

✵ насыщенный и ненасыщенный;

✵ сухой, смешанный и мокрый (тузлучный).

При теплом посоле концентрация соли 15-20 % достигается в мясе рыб в течение суток; при охлажденном посоле - более суток, холодный посол используется для крупных и жирных рыб.

При насыщенном посоле концентрация соли в тузлуке должна быть более 20 %.

При сухом посоле рыба перемешивается с кристаллами соли, при мокром и тузлучном погружается в солевой раствор, при смешанном способе рыба сначала перемешивается с солью, а затем сразу же добавляется раствор соли.

Последний способ находит все более широкое применение, так как при таком посоле образуется система рыба-соль-тузлук, в которой хорошо идет перемещение NaCl из тузлука в ткани рыбы и одновременно осмотический перенос воды из клеток рыбы в тузлук. Перемещение в двух направлениях идет до тех пор, пока не наступит равновесная концентрация соли в тузлуке и мышечной ткани.

Во время посола рыба теряет воду и поглощает соль. В течение первых 10-15 сут. в тузлуке увеличивается содержание микроорганизмов, их количество снижается через 2-3 месяца.

В среднем тузлуке общее микробное число составляет 102-104 микробных клеток в 1 см³. В слабосоленой рыбной продукции при повышении температуры хранения общее количество микроорганизмов возрастает и может составить от 10 до 10 клеток в 1 г продукции. Качественный состав микрофлоры такой рыбы весьма разнообразен. Это галофильные бактерии родов Micrococcus, Streptococcus, Corynebacter, а также дрожжи и плесневые грибы. Могут также встречаться возбудители пищевых отравлений - золотистый стафилококк, сальмонеллы, энтерококки.

При сильном сухом посоле 90 % микрофлоры представлено бактериями рода Мicrococcus. Остальные 10 % - бактерии родов Flavobacterium, Achromobacter, Pseudomonas, Sarcina.

8.5. Микрофлора пресервов

Основным консервирующим фактором в пресервах является поваренная соль, содержание которой допускается от 3 до 10 %. Для предохранения пресервов от порчи в них добавляют антисептик (бензойную кислоту или бензоат натрия) в концентрации 0,1 % от массы рыбы. Бензоат натрия подавляет, главным образом, гнилостные бактерии и в меньшей степени плесневые грибы. Молочнокислые бактерии и дрожжи малочувствительны к действию антисептика. В некоторые пресервы вместо бензоата натрия добавляют уксусную кислоту, которая усиливает действие поваренной соли.

Микробная порча пресервов

1. Образование слизи в рассоле. Причиной порока является полимеризация сахарозы, в результате чего образуется соединение оптически левого вращения - леван, или соединение оптически правого вращения - декстран. В рассоле слизь состоит, главным образом, из левана. Ответственными за образование левана являются грамотрицательные палочки, а за образование декстрана - Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum.

2. Газообразование. В пресервах мелкой упаковки наблюдается газообразование, вызываемое развитием гетероферментативных молочнокислых бактерий или лейконостоков (Leuconostoc citrovorum).

Патогенные микробы в пресервах

Благодаря развитию молочнокислых бактерий продукт подкисляется, поэтому С. botulinum размножается очень редко. Контаминация пресервов сальмонеллами не имеет какого-либо значения, так как существующие концентрации соли (до 8 %) препятствуют размножению этих микробов. S. aureus обладает высокой устойчивостью к соли. Контаминация пресервов золотистым стафилококком происходит, в основном, от обслуживающего персонала. Размножение золотистого стафилококка и образование им энтеротоксина может происходить при концентрации соли до 10 %. Для того чтобы подавить образование токсина S. aureus в пресервах, их необходимо хранить при температуре ниже 10 °С.

Задание по теме:

1. Провести бактериоскопический анализ свежей рыбы. Сделать заключение о свежести исследованных проб рыбы.

2. Провести бактериологический анализ рыбы-сырца. Сделать посевы на питательные среды для определения общего количества микробов (КМАФАнМ) и титра бактерий группы кишечных палочек (БГКП).

Контрольные вопросы

1. Какие микроорганизмы присутствуют на поверхности свежей рыбы, в жабрах, кишечнике?

2. Какие микроорганизмы доминируют на охлажденной рыбе при ее хранении?

3. На какие группы подразделяют микроорганизмы по отношению к хлориду натрия?

4. Перечислите способы посола рыбы.

5. Назовите виды порчи пресервов.