Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Репликация и репарация ДНК
Репарация ДНК

ДНК может быть повреждена в результате различных воздействий, включая химические агенты и радиацию.

Наиболее распространенным повреждением ДНК является депуринизация - потеря аденина или гуанина, поскольку связи между пуриновыми основаниями и дезоксирибозой может гидролизоваться водой (рисунок 58). В каждой клетке человека ежедневно происходит 5 000- 10 000 депуринизаций.

Рисунок 58 - Депуринизация нуклеотида

Дезаминирование происходит реже, только 100 раз в день в каждой клетке человека. Соударение молекулы воды с аминогруппой цитозина приводит к спонтанному дезаминированию, в результате чего образуется урацил (рисунок 59).

Поскольку цитозин стандартно спаривается с гуанином, а урацил — с аденином, то, если не исправить дезаминирование, то при следующей репликации ДНК исходная C=G пара мутирует в U=А пару.

Ультрафиолетовый свет или химические канцерогены, такие как бензопирен (который присутствует, например, в табачном дыме), могут также нарушить структуру ДНК.

Рисунок 59 - Дезаминирование ДНК

Поглощение света может привести к тому, что два соседних тиминовых основания образуют тиминовый димер (рисунок 60).

Если не устранить такой дефект, то тиминовый димер создаст нарушение спирали ДНК, которое называется объёмным повреждением (bulky lesion).

Объёмное повреждение ингибирует нормальное спаривание оснований двух спиралей и блокирует репликацию ДНК. Именно поэтому ультрафиолетовое излучение обладает сильным бактерицидным действием и широко используется для стерилизации оборудования. Одна из главных причин гибели бактерий под действием ультрафиолетового облучения состоит в том, что образование большого количества тиминовых димеров нарушает процесс репликации.

Репарацию (восстановление) ДНК осуществляют специализированные ферменты, которые вырезают поврежденные участки и заменяют их неповрежденными. Репарация ДНК возможна именно вследствие двух-нитиевости строения молекулы ДНК. Репарационные ферменты восстанавливают поврежденную нить по матрице (по информации), сохранившейся в неповрежденной нити.

Рисунок 60 - Образование тиминового димера в ДНК

Возможны два типа "вырезания" и репарации поврежденных фрагментов:

1) удаление только "неправильных" нуклеиновых оснований и их замена на "правильные",

2) удаление и замена целых нуклеотидов.

Общими свойствами этих двух типов является:

1) специализированный фермент распознает повреждение ДНК,

2) удаляется поврежденный участок нити,

3) ДНК-полимераза вставляет "правильный" нуклеотид(ы) в соответствии с последовательностью оснований во второй (неповрежденной) нити ДНК,

4) ДНК-лигаза соединяет восстановленный участок ДНК с остальными частями ДНК.

Удалять только нуклеиновые основания нужно, например, в случае утери пурина (депуринизация) или в случае дезаминирования цитозина в урацил. Хотя урацил является нормальным компонентом РНК, с урацилом не образуется нормальный участок ДНК. Такой урацил в составе ДНК распознается и удаляется репарационным ферментом урацил-ДНК-гликозидазой (рисунок 59). Это приводит к тому, что в ДНК образуется "пробел" в том месте, откуда было удален урацил. Не существует фермента, который просто "вставил" бы цитозин на его "место". Вместо этого специальный фермент АР-эндонуклеаза распознает "пробел" и удаляет ту дезоксирибозу, у которой нет нуклеинового основания, разрезая фосфодиэфирные связи с обеих сторон (рисунок 61).

Рисунок 61 - Репарация ДНК: а - первый этап: удаление дефектного нуклеотида; б - второй этап: встраивание нужного нуклеотида ферментом полимераза I

В случае если ДНК повреждена вследствие депуринизации (рисунок 58), AP-эндонуклеаза также удаляет ту дезоксирибозу, которая потеряла пурин. Буквы "АР" в названии фермента означают "яnиримидинный" (apyrimidinic, без пиримидина) или "аnуринный" (apurinic, без пурина).

Процесс вставления пурина или пиримидина в ДНК происходит одинаково во всех случаях (рисунок 61). ДНК-полимераза I вставляет необходимый дезоксирибонуклеотид в "пробел" в нити ДНК. После этого ДНК-лигаза восстанавливает целостность нити ДНК, катализируя образование фосфодиэфирных связей.

Для репарации ДНК в случае образования тиминового димера из поврежденной нити ДНК вырезается сам тиминовый димер вместе с 30 прилежащими нуклеотидами. В этом процессе образуется "оголённый" участок неповрежденной нити ДНК и для того, чтобы избежать атак нуклеаз в то время, пока ДНК-полимераза и ДНК-лигаза восстанавливают повреждение, необходимо присутствие нескольких специфических белковых факторов, защищающих этот "оголённый" участок.

ВЫВОДЫ

Каждая нить родительского дуплекса ДНК работает как матрица для синтеза дочерних цепей и остаётся спаренной с новой цепью, формируя дочерний дуплекс (полуконсервативный механизм). Новые цепи формируются в 5'→3' направлении.

Репликация начинается с последовательности нуклеотидов, называемой ориджином. Каждая эукариотическая хромосомная ДНК содержит множество ориджинов репликации.

ДНК-полимеразы, в отличие от РНК-полимераз, не могут расплетать дуплекс ДНК и не могут инициировать синтез новых цепей, комплементарных матричным цепям.

В репликационной вилке одна дочерняя цепь (лидирующая цепь) наращивается непрерывно. Другая дочерняя цепь (запаздывающая цепь) образуется из набора прерывистых фрагментов Оказаки, синтезированных из праймеров, образующихся через каждые несколько сотен нуклеотидов.

Рибонуклеотиды на 5'-конце каждого фрагмента Оказаки удаляются и замещаются при элонгации 3'-конца соседнего фрагмента Оказаки. В конце, соседние фрагменты Оказаки сшиваются ДНК-лигазой.

Геликазы используют энергию гидролиза АТФ для расплетания родительских (матричных) цепей ДНК. Праймаза синтезирует короткий РНК-праймер, который остаётся связанным с матричной ДНК. Он наращивается с 3'-конца ДНК-полимеразой a (Pol а), образуя короткую (5')РНК-ДНК(3') дочернюю цепь.

Большая часть ДНК в эукариотах синтезируется ДНК-полимеразой (Pol δ), которая удаляет Pol а и продолжает элонгацию дочерней цепи в направлении 5'→3'. Pol δ остаётся стабильно связанной с матричной цепью благодаря присоединению белка Rfc, который, в свою очередь связывается с PCNA, тримерным белком, который окольцовывает дочерний дуплекс ДНК.

Репликация ДНК, как правило, происходит двунаправленно, когда на ориджине формируются две репликационные вилки, которые движутся в противоположных направлениях. Обе матричные нити копируются в каждой из репликационных вилок.

Синтез эукариотических ДНК in vivo регулируется посредством контроля активности МСМ-геликаз, которые инициируют репликацию ДНК на множественных ориджинах, расположенных на хромосомных ДНК.

Наиболее характерными повреждениями ДНК являются депуринизация, дезаминирование и образование тиминовых димеров. Репарация ДНК происходит в два этапа: (1) вырезание поврежденного нуклеотида AP-эндонуклеазой и (2) собственно восстановление поврежденного участка ДНК-полимеразой I и ДНК-лигазой.

Вопросы для самоконтроля

1. Какой процесс называется репликацией ДНК?

2. В чем сходство и различие полуконсервативного и консервативного механизмов репликации ДНК?

3. Какую реакцию катализирует ДНК-полимераза?

4. В чем сходство и различие функционирования ДНК-полимеразы и РНК-полимеразы?

5. Что называется праймером?

6. Что называется репликационной вилкой?

7. Что называется ориджином репликации?

8. Какова функция геликазы в репликации ДНК?

9. В чем сходство и чем отличаются лидирующая и запаздывающая дочерние цепи ДНК?

10. Что такое фрагменты Оказаки?

11. Какой фермент соединяет соседние фрагменты Оказаки?

12. Что такое двунаправленная репликация?

13. В чем отличие функционирования двух полимераз - ДНК-полимеразы-а и ДНК-полимеразы-8 - в процессе репликации ДНК?

14. Что такое дихотомическая репликация?

15. Перечислите наиболее распространенные виды повреждений ДНК.

16. Что такое дезаминирование ДНК?

17. Что такое депуринизация ДНК?

18. В чем сходство и различие депуринизации и дезаминирования ДНК?

19. Почему ультрафиолетовое излучение обладает бактерицидным действием?

20. Что такое образование тиминового димера как объёмного повреждения ДНК?

21. Как происходит репарация ДНК в случае дезаминирования?

22. Как происходит репарация ДНК в случае депуринизации?

23. Как происходит репарация ДНК в случае образования тиминового димера?