Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Аллели и мутации
Анализ двойных мутантов

На основе тщательного анализа мутантного фенотипа, связанного с данным клеточным процессом исследователи могут определить порядок, в котором функционируют гены, а, следовательно, и экспрессированные ими белки. В принципе, такую последовательность можно определить в двух типах процессов:

1) в метаболических цепях, когда исходное вещество через несколько промежуточных этапов превращается в продукт биохимического синтеза,

2) в системах сигнализации, которые регулируют клеточные процессы и используют информационные сигналы, а не химические промежуточные вещества.

8.6.1. Последовательность метаболических преобразований.

Рассмотрим в качестве примера биосинтез триптофана в бактериях. Каждый из ферментов, необходимых для синтеза триптофана, катализирует химическое превращение одного из промежуточных соединений, предавая результаты своей работы друг другу. В Е. coli гены, кодирующие эти ферменты, объединены в trp оперон (см. рисунок 12).

Последовательность действия различных генов этих ферментов, а значит и последовательность биохимических реакций в этой цепи, сначала была определена на основе тех промежуточных соединений, которые накапливались в каждом мутанте.

Однако, в случае сложных синтетических путей, фенотипический анализ мутантов, имеющих дефект в одном из звеньев метаболической цепи, может дать противоречивый и неоднозначный результат, не позволяющий определить порядок реакций в цепи. В этом случае, чтобы определить порядок этапов, необходимо использовать двойные мутации, создающие дефекты в двух этапах цепи (рисунок 80).

Пусть, например, мутация в ферментах А и В приводит к накоплению в клетке некоторых промежуточных соединений 1 и 2, соответственно. Тогда, если двойная мутация приводит к накоплению в системе промежуточного соединения 1, то это свидетельствует о том, что ферменты А и В входят в одну метаболическую цепь, причем действие фермента А предшествует ферменту В.

Рисунок 80 - Анализ метаболической последовательности

8.6.2. Последовательность событий в сигнальной цепи. Экспрессия многих генов эукариот регулируется сигнальными системами клетки, которые инициируются внеклеточными гормонами, факторами роста и прочими сигналами. Такие сигнальные цепи могут включать многочисленные компоненты и анализ с помощью двойных мутаций может прояснить функции и взаимодействия этих компонент.

Необходимым условием в этом случае является то, что эти две мутации должны иметь противоположное влияние на работу одной и той же сигнальной цепи (рисунок 81).

Вообще говоря, одна мутация должна, даже при наличии внеклеточного сигнала, репрессировать экспрессию гена, ответственного за ответ на внешний сигнал. А другая мутация должна, наоборот, стимулировать экспрессию этого гена, даже при отсутствии внешнего сигнала (т.е. обеспечивать конститутивную экспрессию). Как показано на рисунке 81, если два простых регуляторных механизма удовлетворяют этим требованиям (мутация в белке А репрессирует, а мутация в белке В стимулирует экспрессию гена-индикатора), то фенотип двойной мутации может определить порядок, в котором действуют белки, и то, являются ли они негативными или позитивными регуляторами.

В первом случае (рисунок 81 вверху) двойная мутация в белках А и В репрессирует экспрессию гена-индикатора (репортера). Это однозначно свидетельствует о том, что белок А позитивно регулирует (активирует) экспрессию гена-репортера и, в то же время, сам белок А негативно регулируется (ингибируется) белком В.

Рисунок 81 - Анализ сигнальной последовательности

Во втором случае (рисунок 81 внизу) двойная мутация в белках А и В вызывает постоянную (конститутивную) экспрессию гена-репортера. Это однозначно свидетельствует о том, что белок В негативно регулирует экспрессию гена-репортера и, в свою очередь, белок В негативно регулируется белком А.

Два других генетических метода могут дать информацию о том, как взаимодействуют между собой белки, участвующие в одном и том же клеточном процессе. Оба этих метода используют двойные мутации, причем фенотипический эффект первой мутации изменяется при наличии второй мутации.

8.6.3. Супрессорные мутации. Первая методика основана на генетической супрессии (подавлении) (рисунок 82).

Рисунок 82 - Супрессорные и летальные двойные мутации

Пусть точечная мутация приводит к таким структурным изменениям в одном белке (А), которые приводят к утрате способности к ассоциации с другим белком (В), участвующем в том же самом клеточном процессе. Аналогично, мутации в белке В приводят к таким его структурным изменениям, которые ингибируют его способность к взаимодействию с белком А.

Предположим далее, что нормальное функционирование белков А и В зависит от их взаимодействия. Теоретически, специфические структурные изменения в белке А вследствие первой мутации могут быть скомпенсированы (подавлены, супрессированы) изменениями в белке В вследствие второй мутации, в результате чего белки А и В снова смогут взаимодействовать.

В тех редких случаях, когда такие супрессорные мутации действительно имеют место, штаммы, имеющие обе мутантные аллели, будут нормальными, в то время как, штаммы, имеющие только одну из мутантных аллелей, будут иметь мутантный фенотип (рисунок 82(a)).

Таким образом, если одиночные мутации в белках дают мутантный фенотип, а двойные - исходный дикий, то есть основания предполагать, что функции этих белков зависят от их взаимодействия друг с другом. Такая генетическая супрессия наблюдалась в штаммах дрожжей, имеющих мутантную актиновую аллель (act1-1) и другую мутацию (sac6) в другом гене, что дало основание предположить, что белки, кодируемые данными генами, взаимодействуют в живой клетке. Действительно, биохимические исследования, проведенные впоследствии, показали, что два белка Actl и Sac 6 взаимодействуют при формировании актиновых структур в клетке.

8.6.4. Синтетические летальные мутации. Другое явление, называемое синтетической летальностью, образует фенотипический эффект противоположный супрессорному. При этом вредоносный эффект первой мутации значительно усиливается (а не подавляется) второй мутацией в этом же гене (или, в связанном с первым, гене) (кумулятивный эффект).

Одна из таких синтетических летальных мутаций показана на рисунке 82(6). В этом случае гетеродимерный белок частично (а не полностью) инактивируется мутациями в любой из неидентичных субъединиц. Однако, при двойной мутации, затрагивающей оба гена, кодирующих эти субъединицы, взаимодействие между субъединицами уменьшается

настолько, что функционирование белка полностью прекращается и фенотипическое проявление такого дефекта является отчетливым.

Синтетические летальные мутации, имеющие кумулятивный эффект, могут также выявлять вспомогательные гены, которые кодируют белки, функционирующие в резервных (дублирующих) цепях, синтезирующих необходимые клеточные компоненты. Как показано на рисунке 82(b), если любой из двух путей инактивируется мутацией, то оставшийся путь сможет в одиночку обеспечивать клетку необходимым продуктом. Однако если оба пути будут инактивированы одновременно, необходимый продукт не будет синтезирован и такой двойной мутант будет нежизнеспособен.

ВЫВОДЫ

Диплоидные организмы имеют две копии (аллели) каждого гена, в то время как гаплоидные организмы содержат только одну копию.

Рецессивные мутации приводят к потере функции, однако они не проявляются, если имеется нормальная аллель гена. Чтобы рецессивная мутация проявилась в фенотипе, обе аллели должны быть рецессивными.

Доминантные мутации проявляются в фенотипе и в присутствии нормальных аллелей. Фенотип соответствующий доминантной мутации, как правило, демонстрирует возникновение новой функции, однако, в некоторых случаях, проявляется и в потере функции.

При мейозе диплоидная клетка претерпевает одну репликацию ДНК и два клеточных деления, в результате получается четыре гаплоидных клетки в которых материнские и отцовские аллели распределены случайным образом (рисунок 17.2).

Доминантные и рецессивные мутации демонстрируют характерное распределение при скрещивании (рисунок 17.3).

В гаплоидных дрожжах температурно-чувствительные мутации практически используются для идентификации и исследования существенных для выживания генов.

Число функционально связанных генов, вовлеченных в данный клеточный процесс, может быть определено комплементационным анализом.

Порядок, в котором функционируют гены в биосинтетической или сигнальной цепи, может быть определен из анализа фенотипа двойных мутантов с дефектами в двух этапах рассматриваемого клеточного процесса.

Функционально важные взаимодействия между белками могут быть выявлены при анализе фенотипического проявления аллель- специфических супрессорных мутаций или синтетических летальных мутаций.

Вопросы для самоконтроля

1. Что такое аллель?

2. Какое вещество называется мутагеном?

3. Что такое генотип и чем генотип отличается от фенотипа?

4. Что такое фенотип и чем фенотип отличается от генотипа?

5. Какой генотип называют генотипом дикого типа?

6. Какие организмы называются гаплоидными и в чем их отличие от диплоидных организмов?

7. Какие организмы называются диплоидными и в чем их отличие от гаплоидных организмов?

8. Какие организмы называются гетерозиготными и в чем их отличие от гомозиготных организмов?

9. Какие организмы называются гомозиготными и в чем их отличие от гетерозиготных организмов?

10. Какая мутантная аллель называется доминантной и в чем её отличие от рецессивной аллели?

11. Какая мутантная аллель называется рецессивной и в чем её отличие от доминантной аллели?

12. Чему равна доля особей, проявляющих мутантные особенности, во втором поколении при скрещивании гомозиготного мутантного штамма, имеющего доминантную мутантную аллель, с гомозиготным диким штаммом?

13. Чему равна доля особей, проявляющих мутантные особенности, во втором поколении при скрещивании гомозиготного мутантного штамма, имеющего рецессивную мутантную аллель, с гомозиготным диким штаммом?

14. В какой форме (гаплоидной, диплоидной?) могут существовать клетки дрожжей Saccharomyces serevisiael

15. Какие мутации называются "кондиционными"? Приведите примеры.

16. Какая температура называется запрещенной?

17. Какая температура называется разрешающей?

18. Какие мутации называются cdc-мутациями?

19. Какие мутации называются комплементарными?

20. В чем заключается явление генетической комплементарности?

21. В каких процессах возможно методом двойных мутаций определить порядок функционирования генов?

22. Какое явление называется генетической супрессией?

23. Какие мутации называются супрессорными?

24. Какое явление называется синтетической летальностью?

25. Какие мутации называются синтетическими летальными мутациями?