Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Идентификация клонов ДНК
Методики блоттинга

Два комбинированных метода: Саузерн блоттинг и Нозерн блоттинг, в каждом из которых объединены две методики:

1) сепарация методом гель-электрофореза,

2) гибридизация с комплементарными радиоактивными ДНК-пробами для визуализации результата, позволяют детектировать определённые последовательности нуклеотидов в ДНК или РНК в сложных смесях.

11.4.1. Саузерн блоттинг. Метод "Саузерн блоттинг" был назван в честь его изобретателя Е.М. Саузерна (Е.М. Southern). (Буквальный перевод слова "southern" означает "южный", поэтому, иногда, "Саузерн блоттинг" называют "южным блоттингом", хотя никакой связи со сторонами света этот метод не имеет). С помощью этого метода возможно определить специфический рестрикционный фрагмент в сложной смеси фрагментов, полученной разрезанием всего генома человека рестрикционным ферментом (рисунок 105).

В такой смеси находится много фрагментов, имеющих одинаковую или почти одинаковую длину, которые перемещаются вместе в ходе электрофореза под действием внешнего электрического поля. Даже если все фрагменты не разделяются полностью в ходе гель-электрофореза, специфический фрагмент в пределах одной из полос может быть определен посредством гибридизации со специфическим ДНК-зондом. Для этого рестрикционные фрагменты, которые находятся в геле, денатурируют щелочью и переносят на нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану простым промоканием (blotting (англ.) - промокание, blotting- paper - промокательная бумага, промокашка).

Рисунок 105 - Пример использования метода Саузерн блоттинга для смеси, содержащей три различных рестрикционных фрагмента ДНК в геле

Промокание нужно, чтобы на фильтре остались только рестрикционные фрагменты ДНК (а не гель), которые иммобилизуются (фиксируются) на фильтре. Полученную таким способом реплику электрофоретической картины на нитроцеллюлозном фильтре затем инкубируют обеспечивая гибридизацию со специфическими радиоактивными зондами, которые, в свою очередь, предварительно получают, клонируя рестрикционные фрагменты. Те рестрикционные фрагменты ДНК, которые комплементарны радиоактивным зондам, гибридизируются с ними, и их положение на фильтре может быть определено авторадиографией.

11.4.2. Нозерн блоттинг. Одной из характеристических особенностей клонированного гена является информация о том, когда и где в организме этот ген экспрессируется. Экспрессия специфического гена может быть детектирована по наличию в организме соответствующей этому гену мРНК. Такое детектирование по схеме аналогичной Саузерн- блоттингу назвали Нозерн-блоттингом.

(Слово "Нозерн" ("northern" - северный), как комплементарное слову "Саузерн" было выбрано авторами этого названия (среди которых не было ни одного с фамилией Northern) для того, чтобы подчеркнуть родственность и дополнительность методов Саузерн- и Нозерн-блоттинга. Конечно же, буквальный перевод: "южное" или "северное" "промокание" - не имеет никакого смысла).

Образец, содержащий РНК (обычно всю клеточную РНК) сначала денатурируют, обрабатывая, например, формальдегидом, который разрушает водородные связи, формирующие петли РНК, так, чтобы все молекулы РНК стали линейными (без вторичной структуры). Затем молекулы РНК селектируют по размеру (длине) методом гель-электрофореза и переносятся на нитроцеллюлозный фильтр. Так же как и в Саузерн- блоттинге, этот фильтр затем помещается в раствор, содержащий маркированные ДНК-зонды, комплементарные тому гену, наличие которого и необходимо определить.

После этого, фильтр, маркированный гибридизированными ДНК, анализируют с помощью авторадиографии.

Нозерн-блоттинг обычно используют для сравнения количества специфической мРНК в клетке при определённых условиях. Например, на рисунке 106 показан пример анализа экспрессии мРНК ß-глобина в дифференцирующихся клетках эритролейкемии.

Рисунок 106 - Пример Нозерн блоттинга мРНК ß-глобина в ходе клеточной дифференцировки клеток эритролейкемии

На рисунке представлены три ауторадиограммы: (1) - растущей клетки, которая ещё не индуцирована к делению, UN (uninduced), и двух проб, взятых через (2) - 48 часов и (3) - 96 часов из культуры клеток, которые были индуцированы для прекращения роста и начала дифференцировки.

Плотность полос на рисунке 106 пропорциональна количеству мРНК, присутствующей в пробе. Количество мРНК ß-глобина, которое в неиндуцированной клетке ниже порога детектирования Нозерн-блоттингом, через 96 часов возрастает более чем в 1000 раз.

ВЫВОДЫ

Длинные клонированные фрагменты ДНК разрезают на более короткие участки с помощью рестрикционных ферментов; затем их разделяют методом гель-электрофореза и субклонируют в плазмидных векторах ещё до секвенирования или какого-либо другого манипулирования с ними.

Фрагменты ДНК длиной порядка 500 нуклеотидов обычно автоматически секвенируются в компьютеризованных приборах, использующих метод Сангера (дидезокситерминацию нуклеотидной цепи).

Полимеразная цепная реакция обеспечивает экспоненциальную амплификацию единственного специфического сегмента ДНК, если известны последовательности нуклеотидов, на концах этого сегмента.

Метод Саузерн блоттинга, в котором сочетаются методы гель-электрофореза, переноса (промакивания, блоттинга) разделенных полос на фильтр и гибридизации с комплементарными ДНК, помеченными радиоактивными зондами, способен зарегистрировать единственный специфический фрагмент ДНК в сложной смеси. Подобный метод Нозерн блоттинга детектирует специфическую РНК в смеси.

Вопросы для самоконтроля

1. Какое свойство молекул ДНК используется при разделении фрагментов ДНК методом гель-электрофореза?

2. Для чего используют бромистый этидий при гель-электрофорезе ДНК?

3. В чем отличие дидезоксирибонуклеозида от дезоксирибонуклеозида?

4. Как влияет на процесс синтеза ДНК вставка дидезоксирибонуклеозида в растущую цепь ДНК?

5. Для чего необходимы четыре разных флуоресцентных детектора в методе Сангера секвенирования ДНК?

6. Каким свойством должна обладать ДНК-полимераза, чтобы её можно было использовать в полимеразной цепной реакции?

7. Для чего используется тепловая денатурация в полимеразной цепной реакции?

8. Сколько циклов амплификации методом ПЦР достаточно для увеличения числа исходных молекул ДНК в миллион раз?

9. Какие две методики объединены в методе Саузерн-блоттинга?

10. В чем сходство и отличие методик Саузерн-блоттинга и Нозерн-блоттинга?

11. Для чего чаще всего используют методику Нозерн-блоттинга?