Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Использование клонов ДНК
Использование антител

12.4.1. Внутриклеточная локализация белков. Кроме использования с целью синтеза посттрансляционно модифицированных белков, эукариотические экспрессирующие векторы обеспечивают простой способ исследования внутриклеточной локализации данного эукариотического белка.

Для этого клонированная кДНК модифицируется добавлением к ней короткой ДНК-последовательности, кодирующей эпитоп - аминокислотную последовательность, которую распознает данное моноклональное антитело.

А к данным моноклональным антителам, в свою очередь, ковалентно присоединяют флуоресцирующие молекулы.

После трансфекции с плазмидным экспрессирующим вектором, содержащим такую модифицированную кДНК, экспрессированный белок (который маркирован эпитопами) может быть детектирован методом иммунофлуоресцентной маркировки клетки с помощью моноклональных антител, специфических для данного эпитопа.

Маркировка эпитопами экономит время, необходимое для поиска и выделения нового моноклонального антитела, специфического для данного белка.

12.4.2. Иммунологический скрининг. В отсутствие ДНК-зонда для скрининга геномной библиотеки можно использовать иммунологический скрининг. Например, если клонированный ген экспрессируется, то его продукт - весь белок или его часть - можно обнаружить иммунологическими методами. Технически эта процедура имеет много общего с гибридизацией. Все клеточные линии (клоны) библиотеки высевают на чашки с питательной средой. Выросшие колонии переносят на фильтр, клетки лизируют, а высвободившиеся белки фиксируют на фильтре. На рисунке 111(a) схематически изображен такой белок-мишень на подложке.

Рисунок 111 - Схема иммунологического скрининга

Затем на фильтр наносят первые антитела, которые специфически связываются с данным белком (антигеном) (рисунок 111(6)), все несвязавшиеся антитела удаляют, а фильтр помещают в раствор вторых антител, специфичных в отношении первых антител (рисунок 11 1(b)).

Во многих тест-системах используют конъюгаты вторых антител с ферментом (Е), например, с щелочной фосфатазой. После отмывания фильтра добавляют бесцветный субстрат. Если вторые антитела связываются с первыми, то под действием фермента происходит гидролиз субстрата с образованием окрашенного вещества в том месте, где идет реакция (рисунок 111(г)).

Те клетки на чашке, которые соответствуют окрашенным пятнам на фильтре, содержат или полноразмерный ген, или достаточно протяженный его участок, обеспечивающий синтез белкового продукта, узнаваемого первыми антителами. По окончании иммунологического скрининга геномной библиотеки необходимо определить, какой именно из отобранных клонов содержит полноразмерный ген.

ВЫВОДЫ

Экспрессия векторов на основе плазмид позволяет синтезировать необходимое количество данного белка, если кодирующая его кДНК была предварительно клонирована. Особенностью таких векторов является наличие в их составе промотора, связанного с кДНК, который обеспечивает интенсивную транскрипцию.

В результате слияния клетки В-лимфоцита и "бессмертной" клетки миеломы образуется гибридная клетка, которая может размножаться, формируя клон, называемый гибридомой. Поскольку каждый индивидуальный В-лимфоцит синтезирует антитела специфичные для одного антигенного детерминанта (эпитопа), то гибридома производит только моноклональные антитела, синтезируемые исходной родительской клеткой В-лимфоцита.

Среда HAT используется для изоляции клеток гибридомы, равно как и гибридных клеток других типов.

Эукариотические экспрессирующие векторы могут быть использованы для клонирования генов в клетках дрожжей или млекопитающих. Важным применением этих методов является маркировка белков эпитопами для детектирования их антителами и иммунологический скрининг.

Вопросы для самоконтроля

1. В каких случаях необходимо использовать экспрессирование клонов ДНК в клетках животных, а не в бактериальных клетках?

2. Какой процесс называется трансфекцией?

3. В чем сходство и отличие нестационарной и стабильной трансфекции?

4. В чем сходство и отличие моноклональных и поликлональных антител?

5. Что такое гибридома и как её получают?

6. В чем заключается метод маркировки эпитопами и для чего он используется?

7. Как проводится иммунологический скрининг?