РОСТ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БИООБЪЕКТОВ - В. М. Самыгин - 2016

ГЛАВА 13. СТАБИЛИЗАЦИЯ СВОЙСТВ И ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Правильное хранение культур является чрезвычайно важной проблемой, поскольку потеря или изменение их свойств из-за неправильного хранения мешают выполнению многих научных программ. Основной задачей хранения является поддержание жизнедеятельности клеток и чистоты культуры, а также предупреждение изменений и мутаций, то есть сохранение микроорганизма в состоянии, максимально близком к исходно выделенному штамму. Существует много методов хранения бактерий, однако не все штаммы при использовании какого-либо из них ведут себя одинаково. Выбор метода зачастую определяется наличием оборудования, места для хранения и квалифицированных сотрудников.

13.1. Методы непродолжительного хранения

Традиционным методом хранения бактериальных культур является их периодический пересев на свежие среды. Интервал между пересевами зависит от микроорганизма, используемой среды и внешних условий. Некоторые бактерии следует пересевать через день, другие - через несколько недель или месяцев. При использовании этого метода для хранений культур должны быть соблюдены три условия:

1) подходящая поддерживающая среда;

2) идеальная температура хранения;

3) необходимая частота пересевов.

Предпочтительнее использовать минимальные среды, поскольку в них процессы метаболизма в клетках идут с пониженными скоростями и поэтому промежутки между пересевами удлиняются. Однако для роста некоторых бактерий требуются комплексные среды, или же для сохранения их специфических физиологических свойств необходимо присутствие в среде сложных соединений. В таких случаях могут потребоваться более частые пересевы, связанные с ускоренным ростом или накоплением конечного продукта метаболизма.

Простейший способ - это хранение культур микроорганизмов при комнатной температуре в штативе или специальном боксе. При таком способе необходим постоянный контроль, так как культуры быстро высыхают. Для уменьшения высыхания культур используют завинчивающиеся крышки с резиновыми прокладками, обертываемые парафильмом. Для уменьшения скорости метаболизма микроорганизмы хранят в холодильнике при 5-8 °С. Используя эти меры, можно сохранять большинство бактерий в течение 3-5 месяцев без пересева. Частоту пересевов (субкультивирование) следует проводить как можно реже во избежание селекции вариантов. После каждого пересева культуру проверяют на чистоту и периодически проводят сокращенную проверку фенотипических свойств. В пересеваемых культурах не следует выделять единичные колонии, поскольку при этом повышается вероятность селекции мутантов. Основными недостатками метода периодического пересева являются: риск заражения, ошибки при обозначении штаммов или наклеивания неправильной этикетки, селекция вариантов или мутантов, возможная потеря культур и необходимость выделения специального места для их хранения.

Многие виды бактерий успешно хранят месяцами или даже годами с помощью простого и дешевого метода - под слоем стерильного минерального масла (например, вазелинового с удельной плотностью 0,8650,890). Однако из-за недостаточной стерильности минерального масла может происходить заражение культур. Масло стерилизуют в сушильном шкафу при 170 °С в течение 1-2 ч, автоклавирование для этой цели применять не рекомендуется. Культуры выращивают на «косяках», в столбиках агара или в жидкой среде соответствующего состава. После появления хорошего роста в пробирку в стерильных условиях наливают слой минерального масла высотой не менее 2 см (косяки агара должны быть покрыты полностью) для защиты от высыхания, а также для уменьшения метаболической активности и замедления роста культур. Покрытые маслом культуры хранят в вертикальном положении в холодильнике. Этому методу присущи такие же недостатки, как и обычному субкультивированию.

Хранение бактерий при температуре от 0 °С до -20 °С не рекомендуется из-за повреждения клеток. Вместе с тем некоторые бактерии при замораживании можно хранить от 6 месяцев до 3 лет.

Большинство культур гибнет при высыхании в лабораторных условиях. Однако некоторые культуры, особенно спорообразующие бактерии, могут храниться годами, если высушивать их в соответствующей среде (в почве, на полосках или дисках стерильной фильтровальной бумаги, в высушенных каплях или дисках желатины).

13.2. Методы длительного хранения

Лиофилизация, или высушивание из замороженного состояния, является одним из самых экономичных и эффективных методов длительного хранения бактерий и других микроорганизмов. При ее использовании многие физиологически разнородные виды бактерий и бактериофаги удается сохранять в жизнеспособном состоянии 30 лет и более. Лиофилизация заключается в удалении воды из замороженных суспензий путем сублимации при низком давлении, то есть при этом вода испаряется, минуя жидкую фазу. Высушенные клетки сохраняются довольно долго, если защитить их от действия кислорода, влаги и света. В любой момент клетки можно перевести в гидратированное исходное состояние.

Лиофилизацию проводят разными способами с помощью различных приборов. Простейший из них представляет собой эксикатор, который охлаждают, чтобы клеточная суспензия во время подключения к вакуумному насосу оставалась в нем замороженной. Чаще используется лиофилизация с центрифугированием и предварительное замораживание.

Успех лиофилизации зависит от качества используемых клеток, насколько они жизнеспособны и в каких условиях они выросли. Выращивают достаточно большое количество клеток, чтобы в суспензии содержалось не менее 10⁸ кл/мл. Клетки собирают в период максимальной стабильности и жизнеспособности культуры, то есть в поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазах роста.

Для подготовки клеток к лиофилизации их суспендируют в среде, содержащей криопротекторы. В качестве криопротекторов используют 20 %-ное снятое молоко, 24 %-ный раствор сахарозы, разведенный равным объемом ростовой среды, 10 %-ный раствор декстрана, лошадиную сыворотку, инозит и др. В стерильных условиях собирают клетки, выросшие на поверхности агара. Клетки, выросшие в жидкой среде, отделяют в стерильных условиях центрифугированием и затем суспендируют осадок, чтобы получилась суспензия, содержащая, по меньшей мере, 10⁶ кл/мл. Эту процедуру применяют в том случае, когда в качестве криопротектора используется 20 %-ное снятое молоко или 24 %-ный раствор сахарозы. Лиофилизованные культуры хранят при температуре ниже 5 °С. Если культуры находятся в холодильнике при -3° С или -69 °С, они сохраняются лучше. При комнатной температуре лиофилизованные культуры хранить нельзя.

При восстановлении культур из лиофилизованных клеток, прежде чем открыть ампулы, их надрезают трехгранной пилочкой на расстоянии около 2,5 см от верхнего конца, а затем дезинфицируют, протирая 70 %-ным спиртом. Обертывают ампулу стерильной марлей и обламывают надпиленный конец. Обычно это делают в вытяжном шкафу, а в случае патогенных бактерий - в специальном закрытом боксе. Перед тем как внести в ампулу жидкую среду, обломанный конец слегка обжигают. Жидкую среду вносят в ампулу стерильным шприцем с иглой и извлекают суспензию бактерий им же.

Лиофилизованную культуру переводят в суспензию сразу после вскрытия ампул, добавляя в каждую 0,3-0,4 мл соответствующей стерильной жидкой среды. Суспензию в ампулах хорошо перемешивают и переносят в пробирки с 5 мл жидкой среды. После тщательного перемешивания отбирают 0,2 мл суспензии и наносят на плотную или полужидкую среду того же состава. Необходимо проверять чистоту культуры до лиофилизации и после нее. Для этого суспензию клеток стерильно разводят и делают посев штрихом на плотные среды. Пробирки и чашки со средой инкубируют при оптимальной для бактерий температуре и, как только начинается их рост, делают пересев на свежую среду, чтобы убедиться в чистоте культуры. Рост бактерий, подвергшихся лиофилизации, часто начинается после длительной лаг-фазы. Поэтому нельзя делать заключение о гибели культуры, если инкубация была недостаточно длительной.

Чтобы определить, насколько эффективен процесс высушивания бактерий в замороженном состоянии, проверяют их жизнеспособность как до, так и после лиофилизации. Кроме того, следует проводить периодические проверки, подтверждающие жизнеспособность хранящихся лиофилизованных культур. Их желательно также проверять на случай появления каких-либо изменений в свойствах бактерий в результате замораживания- высушивания или длительного хранения.

Бактериальные культуры длительно сохраняются также в морозильниках с очень низкими температурами (например, при -70 °С). Такой метод вполне пригоден для многих бактерий.

Некоторые виды бактерий, не поддающихся лиофилизации, удается длительно сохранять в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (-196 °С) или в его парах (-150 °С) в хорошо изолированных резервуарах (ультразамораживание). Многие бактерии в таких условиях не утрачивают фенотипические свойства в течение >15 лет. При хранении бактерий в жидком азоте применяют криопротекторы двух типов. К первому относятся глицерин и диметилсульфоксид (ДМС), которые легко проходят через клеточную мембрану и обеспечивают как внутриклеточную, так и внеклеточную защиту от замораживания.

Ко второму типу криопротекторов относятся такие вещества, как сахароза, лактоза, глюкоза, манит, сорбит, декстран, поливинилпирролидон и полигликоль, которые обеспечивают защитное действие на наружной поверхности клеточной мембраны. Протекторы первого типа, то есть глицерин и ДМС, оказались более эффективными и пригодными для широкого круга бактерий. Глицерин и ДМС обычно добавляют в ростовую среду в концентрации 10 % и 5 % (объем/объем) соответственно. Глицерин стерилизуют автоклавированием 15 мин при 10⁴ Па. Стерилизацию ДМС осуществляют фильтрованием, используя пористые свечи Села с размером пор 03, ДМС собирают порциями по 10-15 мл в стерильные пробирки и хранят в замороженном состоянии при 5 °С (ДМС замерзает при 18 °С). Из-за накопления продуктов окислительного распада ДМС в открытых бутылях хранят не более месяца.

В выживании бактерий после замораживания жидким азотом важную роль играет физиологическое состояние культуры. В основном в замороженном состоянии хранят активно растущие клетки из культур в середине или в конце экспоненциальной фазы роста. Клетки выращивают в соответствующей среде. В случае жидких культур клетки отделяют в стерильных условиях центрифугированием и ресуспендируют осадок в стерильной свежей среде, содержащей или 10 % (объем/объем) глицерина (готовят добавлением 20 %-ного глицерина к равному объему стерильной среды), или 5 % (объем/объем) ДМС (приготовленного добавлением соответствующего количества 1 00 %-ного ДМС к стерильной среде). В случае роста культур на агаре клетки смывают с его поверхности стерильной жидкой средой, содержащей подходящий криопротектор, и разливают в стерильные маркированные ампулы по 0,4 мл суспензии, содержащей не менее 108 кл/мл. В случае непатогенных бактерий ампулу перед запаиванием охлаждают при 4 °С не менее 30 мин. Затем ее нагревают над местом круговой насечки (надрезом) стекла, вращая в пламени в течение нескольких секунд, чтобы удалить влагу. Эта процедура позволяет избежать увеличения давления внутри ампулы, которое может привести к появлению пузырей в процессе ее запаивания. Запаивать ампулы желательно с помощью оборудованного кислородно-газовой горелкой устройства, предназначенного для вытягивания и запаивания стекла. Запаянные ампулы проверяют на герметичность. Для этого ампулы оставляют на 30 мин при 5 °С в 0,05 %-ном растворе метиленового синего. Плохо запаянные ампулы обнаруживают по проникновению в них краски.

Наилучшие результаты по выживанию и восстановлению бактериальных культур наблюдались в случае медленного охлаждения клеток, например, со скоростью 1 °С/мин. Быстрое нагревание замороженных микроорганизмов или спор приводит к их быстрому восстановлению (оживлению). Чтобы оживить замороженные культуры, их быстро оттаивают в водяной бане при 37 °С и слабом встряхивании, пока не растает весь лед. В случае стеклянных ампул для этого обычно требуется 40-60 сек, а в случае полипропиленовых - 60-120 с. Сразу же после оттаивания ампулу извлекают из водяной бани и дезинфицируют ее 70 %-ным этанолом. Ампулу вскрывают, и в стерильных условиях переносят культуру в свежую среду. Необходимо помнить, что при извлечении замороженных стеклянных ампул из жидкого азота не исключена возможность взрыва, поэтому во время этой процедуры следует надевать перчатки и защищать экраном лицо. Для определения эффективности метода хранения каждый штамм проверяют на жизнеспособность.