Основи імунології - Курс лекцій М. В. Скок - Київ 2002
Розділ IІ. Механізми імунної відповіді
Лекція 10. Активація та механізм дії цитотоксичних Т лімфоцитів (ЦТЛ). Апоптоз
1. Активація ЦТЛ.
Активація попередників ЦТЛ загалом нагадує таку для CD4+ Т-хелперів. У порівнянні з ними, CDS-позитивні ЦТЛ є потенційно більш деструктивними для організму і тому для своєї активації потребують більше додаткових сигналів.
ЦТЛ впізнають ендогенні антигени (серед яких віруси та внутрішньоклітинні паразити) у комплексі з МНС І; їх головним активатором є цитокін ІЛ-2. Відомі три джерела ІЛ-2 для активації попередника ЦТЛ.
1. Якщо антиген представлено клітиною, що експресує високі рівні В7.1 (наприклад, дендритною клітиною), то взаємодія В7.1 - CD2S призводить до синтезу ІЛ-2 самим попередником ЦТЛ. Одночасно починає експресуватися рецептор до ІЛ-2. В результаті, ІЛ-2 працює як аутокринний активатор і стимулює проліферацію та диференціювання попередника ЦТЛ.
2. Якщо антиген представлено макрофагом або В лімфоцитом, то одночасна активація CD4+ клітин через CD40 - CD40L призводить до підвищення експресії В7.1 і далі по типу 1.
3. ІЛ-2 продукується в результаті активації Тх1. ІФН-гамма, що також продукується Тх1, сприяє підвищенню рівнів експресії МНС І і ІІ і, таким чином, більш ефективному представленню антигенів.
В результаті дії ІЛ-2 попередник ЦТЛ починає ділитися і диференціюватися. Диференціювання полягає в тому, що CD8+ клітина починає експресувати поверхневий білок FasL і синтезувати спеціальні білки: перфорін, гранзими та гранулізін. FasL взаємодіє із білком Fas на поверхні клітини-мішені і є провідником апоптозу (дивись нижче). Перфорін, гранзими і гранулізін накопичуються у спеціальних гранулах і екзоцитуються при контакті ЦТЛ із клітиною-мішенню.
2. Механізм дії ЦТЛ.
Контакт ЦТЛ із клітиною-мішенню відбувається за рахунок взаємодії ряду поверхневих молекул:
- Т-рецептор/СБ3 - MHC I/антиген
- CD8 - MHC I
- LFA1 - ICAM1
- CD2 - LFA3
Поверхня контакту дуже велика і щільна. В результаті проходження сигналу крізь Т-рецептор відбувається швидка переорієнтація цитоскелету, комплексу Гольджі та цитотоксичних гранул. Через 10 хвилин вони вже підходять до поверхні контакту ЦТЛ - клітина-мішень. Усі процеси лізісу відбуваються тільки у місці контакту двох клітин, тобто є цілеспрямованими. Вважають, що гранули утворюються на перехрещенні біосинтетичного та ендосомального шляхів (по аналогії з метаболізмом МНС ІІ) і є мультивезикулярними ендосомами. В процесі екзоцитозу гранули зливаються із мембраною ЦТЛ. На мембранах гранул знайдено всі компоненти взаємодії ЦТЛ із мішенню: T-рецептор, CD3, CD8 та МНС І.
Перфорін - білок з молекулярною масою 70 КДа, гомологічний С9 компоненту комплемента і діє подібним чином: взаємодіє із фосфорилхоліновими голівками мембранних фосфоліпідів, включається у ліпідний бішар і полімеризується у трансмембранну трубку. В результаті в мембрані утворюються пори діаметром 5 і 16нм.
Гранзими - протеолітичні ферменти, що потрапляють у клітину-мішень як крізь пору, пробиту перфоріном, так і через спеціальні рецептори. Вони включають у клітині-мішені механізми апоптозу.
ЦТЛ необхідні для знищення клітин, інфікованих вірусами і внутрішньоклітинними патогенами. Відомо, що деякі із них розвинулись в процесі еволюції так, щоб уникнути попадання в фагоцитарні вакуолі (Listeria monocytogenes, Trypanosoma cruzi). Деякі мікроорганізми фагоцитуються макрофагами і продовжують існувати всередині фагосом (Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Micobacterium tuberculosis). Після лізісу клітини-мішені всі вони потрапляють у міжклітинне середовище і здатні інфікувати інші клітини. Для знищення таких звільнених патогенів ЦТЛ екзоцитують спеціальні речовини, одна з яких називається гранулізін. Він присутній у гранулах як ЦТЛ, так і природних кілерів і посідає мікробіцидної активності. Гранулізін діє безпосередньо на мікроорганізм, пошкоджуючи його мембрану.
Необхідно зазначити, що ЦТЛ не є гомогенною популяцією клітин. Цитотоксичний ефект може бути досягнутий кількома шляхами і за рахунок різних типів взаємодій, що підвищує надійність імунного захисту. Так, класичні CD8+CD4+ ЦТЛ знищують свої мішені переважно за допомогою цитотоксичних гранул. Подвійно негативні ЦТЛ, CD8+CD4+, стимулюють в клітинах-мішенях Fas-залежний апоптоз. Існує популяція ЦТЛ, які впізнають антигени у комплексі не з МНС І, а з іншою молекулою CD1, яка зокрема ефективно представляє ліпідні антигени. І, нарешті, γδТ клітини впізнають вільні антигени, тобто можуть знищити бактеріальні клітини як такі.
В останні роки було з’ясовано, що дихотомія, подібна CD4+ Т-хелперам, спостерігається і для CD8+ цитотоксичних Т лімфоцитів. Там теж існують субпопуляції, що відрізняються за спектром лімфокінів, необхідних для їх розвитку і діяльності. Не виключено, що частина з них може виконувати регуляторні функції.
3. Нормальні (природні) кілери.
Механізм цитотоксичної дії, притаманний ЦТЛ, використовують також інші клітини-захисники - так звані нормальні, або природні, кілери. Морфологічно природні кілери є типовими лімфоцитами, вони диференціюються в кістковому мозку та тимусі із спільного із Т лімфоцитами попередника, але не експресують генів антиген-специфічних рецепторів, тобто не впізнають антиген подібно до Т лімфоцитів. Вони мають цитолітичний аппарат, подібний до ЦТЛ, і продукують цитокіни, подібно до Тх (ІФН, ФНП). На відміну від Т лімфоцитів, природні кілери реалізують свої ефекторні функції при першому ж контакті із мішенню, тобто не потребують стадії проліферації. Вони вражають мішені як шляхом контактного лізису, так і розчинними факторами, які руйнують ДНК клітин-мішеней і внутрішньоклітинних вірусів, супресують реплікацію вірусів, посідають бактерицидної, фунгістатичної та анти-протозойної активності. Природні кілери приймають участь у знищенні інфікованих клітин, відторгненні трансплантатів і є одними з головних чинників протипухлинного захисту.
Механізм активації природних кілерів відрізняється від такого у Т лімфоцитів. Природні кілери несуть два типи рецепторів. Перший тип - це лектиноподібні білки, які впізнають олігосахариди гангліозидів і глюкозоаміногліканів клітинних мембран. Зв’язування таких рецепторів генерує активаційний сигнал в клітині. Другий тип рецепторів впізнає консервативні ділянки власних МНС; зв’язування цих рецепторів генерує інгібіторний сигнал. Активація природних кілерів відбувається при порушенні балансу активаційних і інгібіторних сигналів, тобто руйнуванню піддаються клітини, що не мають достатньої кількості власних МНС: клітини мікроорганізмів, алогенні клітини трансплантатів, пухлинні клітини, в яких знижено експресію МНС І, і навіть нормальні власні клітини, що інтенсивно діляться. Гібриди першого покоління відторгають клітини одного із батьків, оскільки на них немає антигенів гістосумісності другого генотипу. Таким чином, нормальні кілери впізнають «чуже» за відсутністю «свого». Вони є проміжним етапом між природним і надбаним імунітетом. Вони морфологічно схожі до Т лімфоцитів, мають спільні з ними етапи диференціювання, подібний ефекторний (цитолітичний) аппарат і здатні відрізняти алогенні МНС. З іншого боку, природні кілери не експресують генів, що підлягають перебудові, і, відповідно, не мають рецепторів, подібних до імуноглобулінів чи Т-клітинних рецепторів. Їхні ефекторні реакції реалізуються швидше, ніж у ЦТЛ. Клітини, подібні до природних кілерів, знаходять навіть у бесхребетних організмів, які теж можуть впізнавати «чуже» за відсутністю «свого». Це означає, що природні кілери є древніми клітинами-захисниками, яких ми успадкували від далеких предків. В ході еволюції утворилися і клітини, проміжні між природними кілерами і т лімфоцитами - це так звані НК-подібні Т лімфоцити. Вони несуть на своїй поверхні як антиген-специфічний рецептор, так і активаційний рецептор природних кілерів. Таких клітин багато в кістковому мозку і печінці, вони мають обмежений репертуар Т- рецепторів, продукують гамма-ІФН і посідають цитотоксичної активності.
Таким чином, природа випробувала різні засоби знищення агентів, що відрізняються від клітин власного організму; специфічні імунні реакції є тільки невеликою надбудовою величезного масиву неспецифічного (природног) імунітету.
4. Апоптоз.
Одним із механізмів знищення клітин-мішеней в процесі цитотоксичних імунних реакцій є включення в клітині шляху запрограмованої загибелі - апоптозу. Цей шлях має надзвичайно велике значення для життєдіяльності будь-якого організму: ембріонального розвитку, диференціювання і атрофії тканин. Біологічні системи, як відомо, забезпечують свою надійність, зокрема, за рахунок виробництва перебільшених кількостей клітин, зародків і особистостей. Із них відбираються, виживають ті, що найбільш досконало виконують свою функцію. На рівні організму теж постійно ідуть процеси відбору, контролю за якістю клітин; недосконалі знищуються. Наприклад, в процесі ембріонального розвитку утворюється велика кількість нервових клітин, із яких тільки невелика частина виживає і виконує свої функції у дорослому стані, всі інші гинуть шляхом апоптозу. Тестом на проходження пунктів контролю є взаємодія рецепторів клітин із певними лігандами. Відсутність такої взаємодії призводить до включення внутрішньоклітинної програми загибелі. Таким чином, апоптоз - це доля клітини у разі відсутності сигналів виживання, інакше кажучи, - шлях дефолту (по умовчанню). Для того, щоб вижити і розвиватися, клітина повинна постійно отримувати сигнали, що проштовхують її по шляху розвитку. Сигнали виживання можуть бути різної природи: розчинними ростовими факторами, цитокінами, або результатом безпосередньої взаємодії клітин між собою чи із зовнішньоклітинним оточенням. Ці фактори необхідні на певних етапах розвитку клітин, а також можуть врятувати клітину від апоптозу, викликаного токсичними агентами.
Апоптоз спостерігається при дегенеративних захворюваннях, наприклад, хворобах Альцгеймера і Паркінсона, де він відіграє патологічну роль. Навпаки, пухлинний ріст стає можливим як раз при порушенні нормальних механізмів знищення трансформованих клітин. В імунологічних процесах апоптоз важливий для селекції репертуару імунних клітин (що буде розглянуто в окремій лекції), їх активації і дії ЦТЛ.
Термін апоптоз було вперше запропоновано в 1972 році для позначення запрограмованого руйнування клітини, яке стимулює їх фагоцитоз макрофагами. Він принципово відрізняється від іншого шляху загибелі клітин - некрозу.
Некроз - це загибель, що супроводжується порушенням зовнішньої мембрани клітини, руйнуванням її органел; відбувається під дією зовнішніх факторів (різке охолодження чи нагрів, зміна вологості, осмотичного тиску) і з звільненням енергії, тобто з підвищенням ентропії системи.
Апоптоз - це активний процес, який супроводжується активацією певних генів. В результаті органели клітини не руйнуються, мембрана зберігає свою рігідність, відбувається конденсація хроматину, утворення типових апоптичних тілець і характерна міжнуклеосомна фрагментація ДНК. Мембрана змінюється так, що стимулює фагоцитоз зруйнованої клітини макрофагами. Загалом, процес потребує зовнішньої енергії, тобто іде із зменшенням ентропії.
Бум вивчення апоптозу прийшовся на 90-ті роки, коли було знайдено більше двох десятків молекул, що приймають участь в цьому процесі, і визначено загальні механізми апоптозу.
5. Механізми апоптозу (Рис. 19).
A) Рецептори смерті.
Першим рецептором апоптозу, ідентифікованим наприкінці 80-х років, був білок Fas (CD95). Цей білок відноситься до родини білків CD40 і рецептору до TNF. Апоптоз наступає після того, як Fasзв’яже свій специфічний ліганд, який так і називають Fas-ліганд (FasL). Fas-ліганд відноситься до родини TNFα і СD40L. Fas і Fas-L можуть бути експресовані як на різних клітинах, взаємодія яких генерує сигнал смерті (як у випадку ЦТЛ), так і на одній і тій самій клітині: в такому разі вони взаємодіють між собою за рахунок тікучості, вигинання мембрани. Рівень експресії гену fasвизначає здатність клітини до апоптозу. Так, кількість білка Fas на мембрані Т лімфоцитів збільшується при зв’язуванні антигену із Т-клітинним рецептором: таким чином клітина, що зустрілася з антигеном, підсилює контроль за своєю діяльністю для того, щоб краще загинути, ніж відповісти на антиген недосконало. І, навпаки, зв’язування поверхневих імуноглобулінів на В лімфоцитах в зародкових центрах лімфоїдних органів захищає їх від апоптозу шляхом зниження рівню білка Fas.
Пізніше було відкрито цілу родину рецепторів смерті, подібних Fas, до яких відносяться також рецептори до TNF. Всі вони посиленно експресуються під дією екстремальних умов навколишнього середовища, тобто клітина сама включає механізм запрограмованої загибелі. Сигнал смерті також передають рецептори до гранзимів.
Б) Сигнальні каскади апоптозу.
Умовою передачі сигналу загибелі є наявність в цитоплазматичній частині рецепторів певних пептидних мотивів, названих «доменами смерті». Домени смерті, за участю специфічних кіназ і фосфатаз, запускають всередині клітини аутокаталітичний каскад, що призводить до протеолітичної модифікації багатьох субстратів. Його виконують спеціальні білки, названі каспазами(caspases, від наявності цистеїну (Cys) в активному центрі і аспарагіну (Asp) у сайті розщеплення). У ссавців відомо близько десяти таких білків. В клітині, що нормально функціонує, каспази знаходяться у неактивному стані. Поштовхом до їх активації можуть бути:
1) активація доменів смерті відповідних рецепторів;
2) зв’язування клітиною гранзиму В;
3) ендогенний фактор - мітохондріальний білок Apaf-1. При зменшенні енергопостачання клітини першими страждають мітохондрії. При цьому із них звільняється цитохром с, який зв’язує Apaf-1, і цей комплекс активує каспазу-3 - апопаїн;
4) церамід - продукт розпаду сфінгомієліну клітинних мембран. За своєю будовою він схожий на діацилгліцерол, але, на відміну від останнього, запускає сигнальний каскад загибелі, а не активації.
Таким чином, зрозуміло, що існує декілька потенційних шляхів апоптозу, що спрацьовують під дією різних ендогенних і екзогенних факторів.
B) Гени апоптозу.
Сигнальні каскади апоптозу призводять до активації певних генів. По-перше, активуються ті ж самі гени передранньої відповіді, що працюють при звичайних процесах активації клітин і є регуляторами транскрипції: c-jun, c-fos, c-myc, тобто процес апоптозу до певної міри іде по звичайному шляху активації. Генами, специфічними для апоптозу, є bax, bcl-2 і р53. Продукт гену baxутворює гомодимер Вах-Вах, який стимулює апоптоз. Продукт гену bcl-2 утворює із Вах гетеродимер Вах-Вс1-2, який є супресором апоптозу. Таким чином, співвідношення Bc1-2:Bax передрікає долю клітини. Зараз відомо досить багато гомологів цих двох білків, які працюють у різних тканинах. Білки типу Bcl-2 можуть посилено експресуватися після впливу на клітину токсичних речовин і захищати її від загибелі.
Активність експресії генів bcl-2 і bax модулюється продуктом гену р53. Цей ген було відкрито як онкосупресорний, тобто той, що сприяє знищенню злоякісно перероджених клітин. Потім було з’ясовано, що білок р53 є сенсором пошкодження ДНК і стимулює апоптоз. На активацію гену р53 покладають великі надії у боротьбі з онкозахворюваннями. Отже, доля клітини при пошкодженні залежить від співвідношення рівнів експресії генів р53 і Bcl-2.
Г) Результати дії каспаз.
Субстратами каспаз є численні клітинні білки, модифікація яких призводить до морфологічних і функціональних змін у клітині. Так, модифікація білка джелсоліна призводить до змін на клітинній мембрані: відбувається транслокація фосфатидилсерина із внутрішньої поверхні на зовнішню, що сприяє розпізнанню і фагоцитозу такої клітини макрофагами. Модифікація ДНК-аз призводить до фрагментації ДНК. Одночасно модифікуються (інактивуються) білки, що контролюють репарацію ДНК. Модифікація протеїнкінази С призводить до втрачання контролю за клітинним циклом. Модифікація адгезивних білків призводить до порушення контактів із сусідніми клітинами і матриксом.
В результаті цих змін клітина набуває рис, характерних для апоптозу: відбувається міжнуклеосомна фрагментація ДНК, внутрішньоклітинне середовище замикається в гранули (апоптичні тільця) і залишки клітини активно знищуються макрофагами.
6. Використання механізмів апоптозу для контролю за життєдіяльністю клітин.
Хімічні канцерогени сприяють розвитку злоякісних новоутворень супресуючи апоптоз. Віруси, що спричиняють злоякісну трансформацію клітин (наприклад, аденовірус Е1, вірус SV40, віруси папіломи і Епштейна-Бара), мають спеціальні гени, продукти яких заважають апоптозу трансформованої клітини. Так, білок Е1В 55КДа зв’язує білок р53 в клітині і таким чином блокує апоптоз. Білок Е1В 19КД зв’язується із ядерними білками клітини, а також із аналогом Bcl-2 і блокує апоптоз, викликаний не тільки цим вірусом, а і TNFα, зв’язуванням Fas, зниженням концентрації сироватки в культуральному середовищі і цитотоксичними агентами. Інші віруси містять інгібітори каспаз, що теж запобігають апоптозу інфікованої клітини, зберігаючи її живою для репродукції віруса.
Штучна індукція апоптозу була б у потребі для подолання злоякісних і аутоімунних захворювань, коли необхідно знищити шкідливі для організму клітини. Так, в онкологічній практиці робляться спроби активувати ген р53. В імунологічних дослідженнях намагаються скласти умови для апоптозу ауто- реактивних клітин за браком костимуляторних сигналів.
Приклад.
При аутоімунному енцефаломієліті (експериментальний аналог множинного склерозу у людини) патогенними є аутоантитіла до компонентів мієлінової оболонки нервів. Експериментально цю хворобу можна викликати проімунізувавши мишу основним білком мієліну. Якщо імунні клітини такої миші перенести іншій генетично подібній особі, то у неї теж розів’ється енцефаломієліт. Якщо ж вилучені імунні клітини обробити in vitro розчинним основним білком мієліну (у відсутності клітин, що презентують антиген, тобто без утворення комплексу антигену з білками МНС) і ІЛ-2, то вони гублять здатність переносити енцефаломієліт, оскільки специфічні Т лімфоцити гинуть шляхом апоптозу.
Резюме.
Природою розроблено механізми знищення інфікованих, трансформованих або недосконало розвинутих клітин макроорганізму. Одним із таких механізмів є запрограмована загибель - апоптоз. Сигналом апоптозу може бути експресія клітиною спеціальних «рецепторів смерті», що відбувається, наприклад, при активаційних процесах, зменшення енергопостачання, а також активна дія цитотоксичних лімфоцитів. В результаті запускається каскад реакцій, що призводить до організованого руйнування клітини. Цей механізм є дуже важливим для розвитку всього організму і зокрема формування репертуару імунних клітин. Цитотоксичні Т лімфоцити викликають загибель інфікованих клітин як шляхом апоптозу, так і прямим руйнуванням мембрани, що призводить до некрозу, а також діють безпосередньо на мікроорганізми, що є інфекційними агентами.