ПІДРУЧНИК ІМУНОЛОГІЯ - Меркьюрі Поділля 2013

ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Імунологічні тести

Методи, основані на вивченні поверхневих маркерів лімфоцитів. Виділення лімфоцитів з периферичної крові методом градієнтного центрифугування.

Як правило, дослідження лімфоцитів в лабораторії включає етап виділення фракції мононуклеарних лейкоцитів (лімфоцитів) з периферичної крові. З цією метою використовують метод виділення клітин на градієнті щільності фікол-пак. Змішуючи фікол і пак в певній пропорції, отримують розчин, що має щільність 1.077 г/див. Кров нашаровують на розчин фіколу (градієнт). В результаті між плазмою і розчином фіколу утворюється ступінчастий градієнт щільності. Після центрифугування еритроцити і гранулоцити проходять крізь фікол і осідають на дно, а мононуклеари (лімфоцити і моноцити) залишаються у вигляді кільця в інтерфазі, т.ч. вдається розділити клітини, що мають щільність нижче (лімфоцити, моноцити) і вище (еритроцити. гранулоцити) ніж 1.077 г/см.

Матеріали і устаткування: 1. Фікол-400 - полісахарид. 2. Пак-рентгеноконтрастна речовина (аналоги: гіпак, ізопак, омніпак, верографін, урографін, уротраст та ін.). 3. Середовище 199. 4. Стерильна дистильована вода. 5. 3% розчин оцтової кислоти. 6. Центрифуга з бакет-ротором. 7. Ареометр з межами вимірів від 1.060 г/см до 1.090 г/см 8. Камера Горяєва. 9. Мікроскоп. 10. Лабораторний посуд, конічні центрифужні пробірки, ваги для урівноваження центрифужних пробірок та ін.

Опис методу

1. Приготування фіколу: 4,32 (8,64) г порошку фіколу-400 розчиняють в 48 (96) мл дистильованої води.

2. Приготування розчину рентгеноконтрастної речовини (наприклад, уротрасту) : 10,14 (20,28) мл 75% розчину уротрасту доводять дистильованою водою до 21 (42) мл.

3. Приготування градієнта щільності: розчини фіколу і уротрасту змішують. За допомогою ареометра вимірюють щільність отриманого розчину, яка повинна складати 1,077 г/см. Якщо щільність вища, ніж необхідно, то додають розчин фіколу, якщо нижче - розчин уротрасту. Градієнт щільності можна зберігати впродовж 30 діб при температурі + 4 в склянці з помаранчевого скла. За відсутності фіколу градієнт щільності можна приготувати тільки з однієї рентгеноконтрастної речовини. З цією метою 10 (20) мл 76% розчину уротрасту змішують з 43,1 (86,2) мл дистильованої води і додають 0,45 (0,9) мл 0,1% розчину хлористого натрію. Отриманий при цьому 14,3% розчин уротрасту має щільність 1,077 г/см і може бути використаний в якості градієнта щільності.

4. Виділення лімфоцитів: периферичну кров з ліктьової вени в об'ємі 10 мл беруть в пробірку, що містить гепарин, в кінцевій концентрації 25 Од в 1 мл крові (1 мл розчину гепарину, що має концентрацію 200-250 Од/мл). Кров повинна відстоятися впродовж 40-60 хв. при кімнатній температурі до чіткого розподілу еритроцитів і плазми.

✵ У центрифужну пробірку наливають 2-3 мл градієнта щільності, на нього нашаровують 4-6 мл плазми, що відстоялася, і верхній шар еритроцитів. Співвідношення об'ємів градієнт: плазма витримують в межах 1:2 - 1:4.

✵ Пробірки центрифугують впродовж 40 хв. в бакет-роторі з прискоренням 200 g (1500-1800 про/хв.) при температурі 20°С. Величину відцентрового прискорення G обчислюють за формулою: G= 1,1 х n2 х R х 1 0 -5 (n - число обертів за хвилину, R - радіус від центру осі центрифуги до межі зіткнення суміші фікол-пака з суспензією, що розділяється, в см). В процесі центрифугування еритроцити і гранулоцити "провалюються" в градієнт і осідають на дно пробірки. На верхній межі градієнта при правильному розподілі утворюється рихле кільце білуватого кольору, що складається в основному з лімфоцитів з домішкою моноцитів. Над шаром лімфоцитів знаходиться плазма. Плазму збирають в окрему пробірку для наступного аналізу на імуноглобуліни; лімфоцити відсмоктують в суху конічну центрифужну пробірку.

✵ До суспензії лімфоцитів додають 3-4 мл середовища 199, що містить 10 % розчин телячої сироватки, і вміст пробірки ретельно перемішують.

Після цього пробірки центрифугують з прискоренням 200-300 g при температурі 20°С, потім надосадкову рідину видаляють, а процедуру відмивання повторюють ще один раз. Замість середовища 199 можна використовувати будь-який буферний розчин рН 7,0-7,2 без іонів Са2+ (наявність іонів Са2+ сприяє конгломерації клітин, їх коагуляції). сироватки IV (АВ) групи крові людини. При використанні останньою потрібна інактивація при 56 °С впродовж 30 хв. і абсорбція еритроцитами. Для цього 0,5 мл осаду відмитих еритроцитів додають до 1 мл сироватки і інкубують впродовж 1 ч при 37 °С, періодично струшуючи. Бажана абсорбція сироватки пулом лейкоцитів, враховуючи можливість наявності антилейкоцитарних антитіл. При використанні людської сироватки необхідно враховувати вплив аутоцитолімфотоксинів, що проявляють максимум активності при 4 °С.

✵ Після відмивання готують робочу концентрацію лімфоцитів, що містить 2х106 клітин в 1 мл (20 клітин у великому квадраті камери Горяєва). Перед приготуванням робочої концентрації вираховують початкову кількість лімфоцитів:

- до 0,1 мл осаду відмитих клітин додають 0,9 мл середовища 199, суспензію ретельно перемішують;

- в чисту пробірку вносять 0,38 мл 3% розчину оцтової кислоти і 0,02 мл суспензії лімфоцитів;

- в камері Горяєва підраховують лімфоцити в 100 великих квадратах і отримане число множать на 50000. Результат відповідає кількості лімфоцитів в 1 мл суспензії. Для приготування робочої концентрації лімфоцитів отримане число ділять на 2х106, з результату віднімають 1, залишок є кількістю поживного середовища 199 в мл, яке необхідно додати в пробірку з лімфоцитами.

Приготовлену за цією методикою суспензію лімфоцитів можна зберігати при температурі + 4 °С впродовж 2 годин.

Нині для ідентифікації поверхневих структур лімфоцитів і ряду інших клітин в основному використовують 3 групи методів : 1) метод визначення субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів з використанням еритроцитарних діагностикумів; 2) метод лазерної проточної цитофлюориметрії; 3) метод визначення Т-лімфоцитів методом спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана (Е-РОК) і В-лімфоцитів методом розеткоутворення з еритроцитами барана в системі ЕАС.

Метод визначення субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів з використанням еритроцитарних діагностикумів "Анти-CD3", "Анти-CD4", "Анти-CD8", "Анти-CD22", "Анти-CD16"

Принцип методу оснований на визначенні субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів за допомогою реакції розеткоутворювання з еритроцитами, на яких адсорбовані моноклональні антитіла проти рецепторів CD3 (Т-лімфоцити), CD4 (Т-хелпери), CD8 (Т-супресори), CD19 або CD22 (В-лімфоцити), CD16 (натуральні кілери).

Облік результатів дослідження проводять у світловому мікроскопі з інерційною системою.

Перелік необхідного устаткування: Центрифуга. Пробірки (10 мл). Термостат. Холодильник. Автоматичні дозатори (20 - 200 мкл). Мікроскоп з імерційною системою. Предметне скло.

Додаткові реагенти: розчин градієнта густини d-1,077. Фізіологічний розчин або фосфатний буфер рН 7,2-7,4. 0,12% розчин глютарового альдегіду. Фарба Романовського-Гімза.

Одержання лейко суспензії. Кров беруть з вени в пробірку з гепарином. Для даних реакцій досить 3 мл крові. Мононуклеарну завись (лімфоцити) одержують на градієнті густини d - 1,077. Відмити клітини 2-3 рази фізіологічним розчином або фосфатним буфером рН 7,2-7,4. Бажана концентрація клітин у зависі 2х106/мл (20 клітин у великому квадраті камери Горяєва).

Підготовка діагностикума. Погойдуванням флакона осад еритроцитів ресуспендують без піноутворювання. Можливе ресуспендування стерильним шприцом ємністю 2 мл: голкою проколюють пробку, набирають суміш і випускають у флакон кілька разів (без піноутворювання). Набирають шприцом кількість, необхідну для роботи (на одну пробу 0,05мл) та переносять у стерильні пробірки.

Проведення дослідження

1. У пробірки вносять 0,05 мл (50 мкл) CD-діагностикума і додають 0,05 мл лімфозависі.

2. Інкубують суміш 40 хв. при 370 °С.

3. Центрифугують при 1000 об/хв. протягом 5 хвилин.

4. Залишають на 1 годину у холодильнику при +40 °С.

5. Відбирають надосадову рідину.

6. Додають до осаду 0,05 мл 0,12% розчину глютарового альдегіду й обережно ресуспензують (без утворювання піни!). Витримують 5-7 хвилин, знову обережно ресуспензують.

7. Роблять мазок приблизно на 1 см² площі знежиреного предметного скла.

8. Висушують, фіксують спиртом і зафарбовують фарбою по Романовському.

9. За допомогою світлового мікроскопу з імерційною системою підраховують відсоток розеткоутворюючих лімфоцитів, що зв’язують не менш 3-х еритроцитів із CD-діагностикумами на 200 клітин.

Не враховувати! Гранулоцити, агрегати клітин, а також лімфоцити, що потрапили в агрегати.

Можна підраховувати розеткоутворюючі лімфоцити в нативному препараті в камері Горяєва.

Оцінка результатів дослідження

1. Відсоток Т-лімфоцитів дорівнює відсотку розеткоутворюючих лімфоцитів із СD3-діагностикумом.

Норма дорослих 50-80% (середнє 60+5%); у дітей - 47-76% (середнє 55+4,8%).

Абсолютна кількість у 1 мкл крові = А х У х С : 10000,

де: А - кількість лейкоцитів у 1 мкл крові, У - відсоток лімфоцитів у формулі крові, С - відсоток розеткоутворюючих Т-лімфоцитів.

2. Відсоток Т-хелперів (Тх) дорівнює відсотку розеткоутворюючих лімфоцитів із СD4-діагностикумом.

Норма 33-46% (середнє 40+3,0%).

3. Відсоток Т-супресорів (Тс) дорівнює відсотку розеткоутворюючих лімфоцитів із СD8-діагностикумом.

Норма 17-30% (середнє 22+1%).

ІРІ - імунорегуляторний індекс. ІРІ: Тх/Тс = 1,4 - 2,0.

4. Відсоток В-лімфоцитів дорівнює відсотку розеткоутворюючих лімфоцитів із СD22-діагностикумом. Абсолютну кількість В-лімфоцитів визначають також як і Т-лімфоцитів.

Норма 17-31% (середнє 23+3,6%).

5. Відсоток натуральних кілерів дорівнює відсотку лімфоцитів, що утворюють розетки із СD16-діагностикумом.

Норма 12-23% (середнє 16+ 4,5%).

Слід зауважити, що мазки рекомендовано робити на добре обезжиреному спирт-ефіром склі в вигляді моношара. Запобігати утворення нашарування клітин. Діагностикуми повинні зберігатися при температурі від G2 до G10 °C. Не допускається замороження!

Імуно-регуляторний індекс (показник CD4/CD8). Окрім визначення чисельності популяцій і субпопуляцій, важливе значення надається обчисленню показника CD4/CD8 - імуно-регуляторного індексу або хелперно-супресорного відношення (норма 1,8±0,4). Зменшення імуно-регуляторного індексу спостерігається при вірусних інфекціях, у новонароджених і при пересадці кісткового мозку, а збільшення - при аутоімунних захворюваннях, алергії (табл. 11).

Таблиця 11. Клінічні приклади порушення імуно-регуляторного індексу (хелперно-супресорного відношення, CD4/CD8)

В той же час, необхідно відмітити, що частина СD8+Т-клітин є кілерами, а частина CD4+ - ефекторами, тому нині не існує єдиного досконалого способу оцінки числа лімфоцитів з супресорною або хелперною активністю. Крім того, антигенна структура Т-хелперів 1 і 2 типів практично ідентична. Ось чому оцінку чисельності субпопуляцій лімфоцитів бажано доповнювати функціональними тестами і визначенням спектру цитокінів.