ПІДРУЧНИК ІМУНОЛОГІЯ - Меркьюрі Поділля 2013

ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вивчення синтезу цитокінів на рівні окремих клітин

Імуноцитохімія. Ідея локалізації антигенів в тканинах за допомогою антитіл вперше була реалізована на початку 40-х років. Згодом імуноцитохімічні методи стали широко застосовуватися в молекулярній клінічній діагностиці, а з середини 70-х рр.., після відкриття моноклональних антитіл, їх роль ще більше зросла.

Імуноцитохімічні (ІЦХ) методи дозволяють локалізувати та ідентифікувати клітинні компоненти (в нашому випадку цитокіни), ґрунтуючись на їх зв'язуванні з антитілами. Місце зв'язування визначають за допомогою мічених антитіл або методом вторинного мічення.

Препарати для ІЦХ можуть бути трьох типів:

а) відбитки;

б) мазки, отримані відповідними цитологічними або гематологічними методами;

в) препарати, отримані центрифугуванням клітинних суспензій. Останній метод кращий, коли в розпорядженні дослідника є біологічні рідини з невеликою кількістю клітин.

Роблять зрізи тканин і інкубують їх у розчині з антитілами до антигену інтересу (цитокіну). Антитіло часто пов'язано з флуоресцентним барвником, так що можна побачити локалізацію антигену. Коли антитіло знаходить антиген і формує з ним комплекс, вільні антитіла відмивають, і флуоресцентний барвник залишається в місцях локалізації антигену. Використовуючи спектрофотометр або флуоресцентний мікроскоп, можна з'ясувати локалізацію флуоресцентного барвника і, отже, визначити, де всередині клітини знаходиться антиген.

Причини широкого застосування ІЦХ очевидні: широкий вибір якісних реагентів, простота реалізації та навчання персоналу навичкам обліку результатів, а при світловій мікроскопії - можливість зіставлення з морфологією, зберігання і транспортування препаратів, відсутність необхідності в вузькоспеціальному обладнанні. Негативними моментами є суб'єктивність візуальної оцінки, труднощі організації контролю якості, неможливість врахування великої кількості клітин і, як наслідок, імовірність неадекватної оцінки малоклітинних популяцій.

ELISpot. Метод ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot) є високочутливою модифікацією методу ІФА, що дозволяє кількісно визначати клітини, що секретують певний цитокін. Висока чутливість методу ELISpot визначається тим, що продукт в момент аналізу знаходиться на поверхні секретуючої клітини, будучи пов'язаним з її рецепторами. Крім того, стимуляція продукції цитокіну відбувається in vitro безпосередньо перед детекцією. В результаті метод ELISpot дозволяє виявляти 1 клітину, що секретувала цитокін з 100000, що в 20-200 разів точніше стандартного ІФА.

Схема методу ELISpot:

1. Цитокін-спеціфічні антитіла мобілізують на дні PVDF мікропланшет.

2. Блокують незв'язані сайти за допомогою протеїну.

3. Додаються клітини без активатора чи з ним. Протягом інкубації клітини активуються і починають виробляти і секретувати цитокіни, які специфічно зв'язуються з первинними антитілами.

4. Відмивають клітини.

5. Додають вторинні антитіла, які або кон'юговані з ферментом або біотінільовані з ним.

6. При використанні біотину додатково додається кон'югат.

7. Додається субстрат, в результаті з'являється забарвлена пляма в місці локалізації клітини, яка секретує цитокін.

8. В результаті підрахунку числа плям c допомогою ELISpot Reader AID в досліджуваних зразках і контролях (без активатора) визначають кількість клітин, що продукують певний цитокін.

Цитофлюориметрія. Це провідний метод у клінічній імунології. Він може бути використаний для оцінки внутрішньоклітинної продукції цитокінів різними клітинними популяціями.

Цитофлюориметрія дозволяє оцінити продукцію цитокіну на рівні однієї клітини за допомогою внутрішньоклітинного фарбування. Комбінація внутрішньоклітинного та поверхневого фарбування дає можливість максимально деталізувати інформацію про клітину-продуцента - приналежність до класу, підкласу, визначити її функціональну активність. Базальний рівень цитокінів у клітинах в стані спокою досить низький, тому попередньо проводять стимуляцію клітин in vitro в присутності індукторів продукції цитокінів та блокаторів внутрішньоклітинного транспорту (брефелдін А, моненсін). Потім фарбують поверхневі маркери, фіксують, пермеабілізують клітини і додають антитіла до внутрішньоклітинних маркерів. Далі клітини поміщають в контейнер для проб проточної цитометрії де вони під тиском впорскуються в центр швидкоплинного в тому ж напрямку потоку рідини через спеціально розроблений наконечник, в результаті чого швидкість руху клітин різко зростає і вони вибудовуються, утворюючи стовпчик, оточений оболонковою рідиною. Геометрія наконечника дозволяє створити умови ламінарного потоку струменя зразка, в результаті чого не відбувається перемішування суспензії досліджуваних клітин з рідиною. Потрапляючи в подальшому в вимірювальну камеру приладу, клітини по черзі перетинаються променем лазера і збуджуються світлом певної довжини хвилі. У свою чергу, клітини посилають світлові сигнали іншої довжини хвилі, які, проходячи через систему оптичних лінз, фільтрів, двоколірних дзеркал, реєструються фотоелектронним помножувачем, що перетворює ці світлові сигнали в електричні, оброблювані комп'ютером. Два або три флуоресцентних сигналу, кожен з яких повідомляє про реакцію одного моноклонального антитіла зі специфічно розпізнаваним антигеном можуть бути зібрані з клітин разом з сигналами переднього (FSC-forward scatter) і бічного світлорозсіювання (SSC-side scatter). Сигнали світлорозсіювання, що характеризують розмір клітини (FSC), а також цитоплазматичні та мембранні особливості (SSC) прив'язують флуоресцентний аналіз до певних популяцій клітин. Отримані дані можуть бути записані, проаналізовані і представлені у вигляді гістограм. При цьому у разі одновимірної гістограми на осі абсцис відкладається інтенсивність флюоресценції клітин, а по осі ординат число клітин з певною інтенсивністю флюоресценції. Підсумувавши отримані дані по всій популяції клітин зразка, можна провести точний кількісний популяційний і субпопуляційний аналізи.

Визначення концентрацій цитокінів в біологічних рідинах імуноферментним методом. Для аналізу моноклональних антитіл використовують імуноферментний твердофазний аналіз - ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent Assay). Це метод виявлення формування імунокомплексів - антитіла з антигеном.

Послідовність виконання методу:

1. Перші моноклональні антитіла (МКАТ) попередньо іммобілізують на внутрішніх поверхнях осередків твердого планшета для ІФА.

2. У перші два вертикальні ряди осередків планшета вносять по 100 мкл стандартів: А - 0 пг/мл досліджуваного цитокіну, В - 50 пг/мл, С - 250 пг/мл, D - 500 пг/мл, Е - 1000 пг/мл, F - 2000 пг/мл цитокіну. В інші осередки вносили по 100 мкл зразків. Зразки та стандарти вносять в рекомендованих буферах. Планшет інкубують протягом 1,5 год при 18-20 °С. Після інкубації розчин з осередків видаляють за допомогою піпетки. Потім осередки тричі промивають внесенням 300 мкл розчину для промивання. Залишки промивання видаляють за допомогою піпетки.

3. Другі МКАТ, мічені біотином, вносять по 100 мкл і інкубують зразки з ними протягом 1,5 годин при безперервному струшуванні при + 18 °С. Після інкубації розчин з осередків видаляють за допомогою піпетки. Осередки тричі промивають внесенням 300 мкл розчину для промивання в кожну з них. Залишки промивання видаляють.

4. Кон'югат стрептавідін-пероксидази, розведений 1:100 буфером, вносять в обсязі 100 мкл до осередку планшету і інкубують при +18 °С і безперервному струшуванні протягом години. Після інкубації розчин з осередків видаляють. За 10-15 хв. до закінчення інкубації готують розчин тетраметілбензидіну. Осередки планшета, після видалення розчину, тричі промивають внесенням 300 мкл розчину для промивання і 3-5 разів дистильованою водою з подальшим видаленням її струшуванням планшету над раковиною. В результаті цих операцій формується «сендвіч», що складається з наступних шарів: фіксоване антитіло - зразок (цитокін), пов'язаний з ферментом антитіла.

5. Додають 200 мкл розчину тетраметілбензидіну. Інкубують протягом 20 хв. при кімнатній температурі в темряві. Зупиняють реакцію додаванням 50 мкл розчину 1Н сірчаної кислоти. Розщеплення субстрату ферментом призводить до зміни забарвлення першого. За зміною забарвлення субстрату дізнаються про присутність цитокіну, який був у зразку. Облік результатів, що визначають активність зв'язаної пероксидази, проводять з використанням автоматичного фотометра для мікропланшетів при довжині хвилі 492 нм, встановлюючи нульове поглинання по лунках зі стандартом без визначеного цитокіну в розчині. Кількісну оцінку результатів проводять методом побудови калібрувальної кривої, що відображає залежність оптичної щільності від концентрації антитіла. Чутливість методу при використанні вітчизняних тест-систем - 5-30 пг / мл.

Переваги імуноферментного методу: висока чутливість; можливість використання мінімальних обсягів досліджуваного матеріалу; стабільність при зберіганні всіх інгредієнтів, необхідних для проведення ІФА (до року і більше); простота проведення реакції; наявність як інструментального (в якісному і кількісному варіанті), так і візуального обліку; можливість автоматизації всіх етапів реакції; відносно низька вартість діагностичних наборів.

Вивчення експресії генів цитокінів. Цитокіни - сигнальні молекули імунної системи. Рівень експресії цих білків має важливе діагностичне значення для підбору імунокоригуючої терапії і прогнозу інтенсивності і спрямованості імунної відповіді. Для того щоб визначити, які цитокіни і в якій кількості синтезуються, широко застосовується метод ПЛР.

Полімеразна ланцюгова реакція - метод, що імітує природну реплікацію ДНК і дозволяє виявити кілька специфічних молекул ДНК в присутності мільйонів інших молекул. Метод заснований на багаторазовому виборчому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів в штучних умовах (in vitro). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і лише в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку. За допомогою ПЛР ампліфікують відносно короткі ділянки ДНК. У звичайному ПЛР-процесі довжина копійованих ДНК-ділянок становить не більше 3000 пар основ. За допомогою суміші різних полімераз, з використанням добавок і за певних умов довжина ПЛР-фрагменту може досягати 20-40 тисяч пар нуклеотидів.

Проведення в лабораторії ПЛР-аналізу відбувається в три етапи: 1) виділення ДНК; 2) ампліфікація ДНК-фрагментів; 3) детекція ДНК-продуктів ампліфікації.

Виділення ДНК - це початковий етап проведення ПЛР-діагностики, суть якого полягає в наступному: лікар бере у пацієнта матеріал для дослідження і піддає його спеціальній обробці. В процесі обробки відбувається розщеплення подвійної спіралі ДНК на окремі нитки. У матеріал пацієнта додається спеціальна рідина, що розчиняє органічні речовини, які заважають «чистоті» проведення реакції. Таким чином видаляються ліпіди, амінокислоти, пептиди, вуглеводи, білки і полісахариди. В результаті утворюється ДНК або РНК.

В основі ампліфікації ДНК і відповідно в основі всього принципу ПЛР-реакції лежить природний для всього живого процес добудовування ДНК-реплікації ДНК, який здійснюється шляхом подвоєння одиничної ланцюжка ДНК.

Почавши з одного-єдиного фрагмента ДНК, лікар-лаборант копіює його і збільшує кількість копій в режимі ланцюгової реакції: після першого циклу у вас вже є 2 фрагмента, після другого циклу - 4, після третього - 8, після четвертого - 16, потім 32,64, 128, 256 ... З кожним циклом відбувається подвоєння числа копій і після двадцяти циклів рахунок вже йде на мільйони, а після тридцяти - на мільярди. Цикл триває лічені хвилини і зводиться до певної зміни температурного режиму в дуже невеликому хімічному реакторі. Тут в розчині в достатній кількості знаходяться всі потрібні компоненти синтезу, перш за все, нуклеотиди, а також проведені тонкі підготовчі хімічні операції для того, щоб з кожного готового відрізка ДНК відразу знімалася точна копія, потім з цієї копії - знову копія, в цьому і полягає розгалужена ланцюгова реакція.

Шляхом приєднання до ланцюга ДНК праймерів утворюються дві короткі, що складаються з двох ланцюгів ділянок ДНК, спіралі, які необхідні для синтезу майбутньої ДНК.

Синтез нового ланцюга відбувається шляхом добудовування кожної з двох ниток ДНК. Процес ампліфікації відбувається за допомогою специфічної ділянки - ДНК-полімерази, який називається лабораторним методом. Полімераза виступає в ролі каталізатора реакції і стежить за послідовним прикріпленням нуклеотидних підстав до зростаючого нового ланцюга ДНК.

Таким чином, ампліфікація ДНК являє собою багаторазове збільшення числа копій ДНК, які специфічні. Всі чисельні повторювані етапи ампліфікації відбуваються при різних температурах. Для проведення ПЛР-аналізу використовується спеціально програмоване обладнання - ПЛР-термостат або ампліфікатор, яке автоматично здійснює зміну температур. Ампліфікація проводиться за заданою програмою, що відповідає виду визначення інфекції. В залежності від програми і виду обумовленої інфекції процес автоматизованої ПЛР займає 2-3 год.

В процесі детекції продуктів ампліфікації проходить поділ отриманої суміші продуктів ампліфікації. До суміші додається спеціальні розчини, які наділяють фрагменти ДНК здатністю флюоресціювати - відбиватися оранжево-червоними смугами.

Аналіз поліморфізму генів цитокінів. Дослідження генів, які контролюють активність цитокінів, і є медіаторами запалення, - одна з важливих завдань у розкритті патогенетичних ланок ініціації та перебігу захворювань, виявлення на ранніх термінах схильності до захворювань. Знання їх ролі в патогенезі багатьох захворювань дозволяє, з одного боку, прогнозувати ризик розвитку патології або тяжкість її перебігу, з іншого - індивідуально підібрати специфічну терапію для конкретного пацієнта.

За експресією прозапальних цитокінів здійснюється постійний генетичний контроль. Розглянемо функціональний поліморфізм гена TNF-α. Ген TNF-α розташований на шостий хромосомі (6p21.3) в локусі, що кодує молекули головного комплексу гістосумісності першого (HLA-A, B, C) і другого класів (HLA-DP, DQ, DR). Розташування в середній частині генома визначає велику варіабельність локусу, зокрема, промоторна зона гена TNF-α включає вісім поліморфних ділянок з одиничними нуклеотидними замінами -1031T/C, -863C/A, -857C/T, -575G/A, -376G/A, -308G/A, -244G/A, -238G/A. Однак найбільш значимими для людини вважаються два. Це одиничні нуклеотидні заміни гуаніну на аденін в положеннях: -308 (GRA) і -238 (GRA), які викликають зміни рівня продукції TNF-α, тобто є функціональними. Позиції -308 і -238 припадають на промотор, що позначається на можливості транскрипційних факторів зв'язуватися з цією частиною гена і, таким чином, впливати на швидкість транскрипції. Поліморфізм - 308 підвищує транскрипційну активність гена TNF-α і, відповідно, продукцію цитокіну. Найбільш активна транскрипція поліморфного гена TNF-α (-308*А) йде в макрофагах: в них вона в 5 разів вище, ніж транскрипція нормального гена -308*G. Враховуючи той факт, що макрофаги - основне джерело TNF-α, їх генетично обумовлена здатність до збільшеної продукції цього прозапального цитокіну може відбиватися на розвитку запальних та імунних реакцій організму.

Ще одною поліморфною ділянкою гена TNF-α, що впливає на продукцію цитокіну, є положення 238. Однак, в даному випадку заміна гуаніну на аденін веде не до підвищення, а до зниження продукції білка. Так, стимуляція клітин цільної крові ліпополісахаридом показала, що клітини з генотипом-238GA синтезують в 1,5 рази менше TNF-α, ніж клітини з генотипом-238GG.

При ревматоїдному артриті провідна роль у патогенезі належить прозапальним цитокінам - IL-1β і TNF-α. При дослідженні було виявлено, що пацієнти, які мають генотип-308G/A гену TNF-α, мають важчий перебіг ревматоїдного артриту, ніж ті, що несуть G/G генотип. У пацієнтів з алелем G/A зазначалися більш ранній початок захворювання, вища активність, більша кількість ерозій. У той же час, в інших популяціях хворих розглянутий алельних варіант гену TNF-α не впливав на тяжкість і перебіг ревматоїдного артриту і не був асоційований з цим захворюванням. При дослідженні поліморфізму гену IL1β в точці (+3953 RT) 5-го екзону було виявлено, що генотип Т/T (А2А2 алель) асоційований з більш активним ревматоїдним артритом порівняно з генотипами C/C і C/T. З інших даних відомо, що наявність алелі Т в цій точці асоційоване з великим числом ерозій при ревматоїдному артриті і високою експресією гена in vitro.

Одним з найбільш негативних наслідків бактеріального інфікування організму є септичний шок. Основним ендогенним медіатором розвитку септичного шоку служить TNF-α. У високих концентраціях він здатний викликати активацію ендотелію, що приводить до розширення судин і падіння артеріального тиску, дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові (ДВЗ-синдрому), поліорганної недостатності, порушення терморегуляції, що в сумі веде до летального результату. При генотипуванні дітей було показано, що присутність хоча б однієї копії високоактивного алеля-308*А в генотипі дитини підвищує ймовірність летального результату в 2,5 рази. Смертність дітей з поліморфним генотипом-308 (AG, AA) була в 3 рази вище в порівнянні з носіями гомозиготного варіанта (-308 GG) гена TNF-α. Те ж стосується і астми: заміна G на A в позиції-308 пов'язана з підвищеним виробленням цього цитокіну, що пов'язане з ризиком розвитку аутоімунної патології. Також виявлений взаємозв'язок підвищеної частоти алеля IL-10-592A з тяжкістю сепсису, розвитком поліорганної недостатності та високою ймовірністю летального результату.

У ВІЛ-інфікованих хворих спостерігається ряд відмінностей з контрольною групою здорових людей в частоті сполучень алельних варіантів генів цитокінів, пов'язаних з появою A/A гомозиготного варіанту гена IL-10 (RR = 2,36), не виявленого у здорових осіб, і відсутністю гомозиготного A/A варіанту гену TNF-α (RR = -12,25), виявленого у 4% здорових жінок. Частота A/G варіанту гену TNF-α в чотири рази вища у хворих (RR = 4,67) за рахунок зниження частоти обох гомозиготних варіантів.

Ген IL1RN кодує IL-1RA і локалізований в 2 хромосомі. Носійство алеля IL1RN*2 пов'язано з підвищеним рівнем циркулюючого IL-1RA і рівнем експресії мРНК в ході запалення. Вплив поліморфізму генів IL1B (кодує IL-1β) і IL1RN на характер запалення можна описати у вигляді наступних тенденцій: носійство немутантів варіантів цих генів визначає адекватну продукцію відповідних білків і регуляцію функціонування системи IL-1; у носіїв генетично зумовленої переваги в сторону продукції IL-1β запалення протікає більш гостро, у носіїв генетично зумовленої переваги в бік вироблення IL-1RA запальний відповідь більш тривалий, що може бути причиною хронізації запалення. Рівень IL-1RA в плазмі крові скоординований і спільно регулюється генами IL1B і IL1RN, а носійство IL1RN*2 відповідальне за підвищений рівень як циркулюючого IL-1RA, так і IL-1β, збільшена активація експресії і продукції, яка є наслідком надлишкового вироблення IL-1RA. Згідно з цією версією, при реалізації запальної відповіді у носіїв генетично зумовленої переваги в бік вироблення IL-1RA, кількість цього білка більша, ніж необхідно для адекватної реалізації запалення, що викликає компенсаторний виробіток ще більшої кількості IL-1β. При цьому і IL-1RA у відповідь виробляється теж більше. Таким чином, носійство поєднань генів IL1B і IL1RN, що визначають перевагу у бік вироблення IL-1RA, призводить до більш тривалої запальної відповіді.

Таким чином, дослідження поліморфізму генів як фактора генетичної схильності до різних захворювань людини відкривають нові можливості у виявленні груп ризику і виборі найбільш оптимальної терапії для кожного пацієнта. В майбутньому можна очікувати появу превентивних методів корекції схильності до широкого спектру захворювань.

Клінічне значення визначення цитокінів. Цитокіни є локальними медіаторами, тому доцільно вимірювати їх рівні у відповідних тканинах після екстракції тканинних протеїнів з біоптатів відповідних органів або в природних рідинах: сечі, слізної рідини, рідини ясенних кишень, бронхо-альвеолярному лаважі, вагінальному секреті, еякуляті, змивах з порожнин, спинномозкової або синовіальної рідини.

Додаткову інформацію про стан імунної системи організму можна отримати при вивченні здатності клітин крові до продукції цитокінів in vitro. Існує дві субпопуляції CD4+Т-хелперів - Т-хелпери 1 і 2 типів, які не мають відмінностей з антигенною структурою: Т-хелпери 1 та 2 типів (Th1 та Th2) мають однакові диференційовані антигени CD3, CD4, CD29, CD45Ra. Разом з тим, Т-хелпери 1 і 2 типів розрізняються за набором (профілем) цитокінів, які вони здатні синтезувати у відповідь на антигенну стимуляцію, і від цього профілю залежить, який з двох основних типів імунної відповіді буде реалізований (клітинній або гуморальний).

Т-хелпери 1 типу продукують інтерлейкіни-2, 3, 12, ІФН-γ і ФНП-β, ГМ-КСФ; вони викликають активацію клітинного імунітету, вироблення цитотоксичних Т-лімфоцитів, натуральних кілерів, макрофагів та Т-ефекторів гіперчутливості уповільненого типу. Thl забезпечуються імунітет проти вірусів, внутрішньоклітинних бактерій і онкогенних клітин. Активність Th1 подавляє інтерлейкін-10.

Т-хелпери 2 типу продукують інтерлейкіни 4, 5, 6, 10 та 13, які активують гуморальну імунну відповідь, В-лімфоцити і алергічне запалення. Стимулюючи продукцію плазматичними клітинами імуноглобулінів IgM, IgG4 та IgA, Th2, забезпечується імунітет проти звичайних (позаклітинних) бактерій і їх токсинів. Активація еозинофілів, тучних клітин і стимуляція синтезу імуноглобуліну Е (IgE) веде до розвитку алергії. Активність Th2 подавляє ІФН-γ.

Рівні вмісту цитокінів в плазмі відображають поточний стан імунної системи і розвиток захисних реакцій in vivo. Спонтанна продукція цитокінів культурою мононуклеарів периферичної крові дозволяє оцінити стан активності відповідних клітин. Підвищена спонтанна продукція цитокінів свідчить про те, що клітини вже активовані антигеном in vivo. Індукована продукція цитокінів дозволяє оцінити потенційну здатність певних клітин відповідати на антигенну стимуляцію. Знижена індукція цитокінів in vitro, наприклад, може служити одним з ознак імунодефіцитного стану. Тому обидва варіанти вивчення рівнів цитокінів як в циркулюючій крові, так і при їх продукції культурами клітин є важливими з точки зору характеристики імунореактивності всього організму і функції окремих ланок імунної системи. Причому для оцінки тяжкості та прогнозування перебігу захворювання доцільно визначати концентрацію як проти-, так і прозапальних цитокінів у динаміці розвитку патології.

Сепсис є результатом небезпечної пошкоджуючої відповіді організму на інфекцію. Сепсис розвивається, коли спочатку відповідь організму на інфекцію посилюється і стає неконтрольованою. Цитокінам відводиться провідна роль у розгортанні медіаторного механізму сепсису. При сепсисі має місце невідрегульована експресія різних цитокінів, тому з метою корекції порушень функцій макрофагів імуномодуляторами необхідно підходити до оцінки порушень співвідношення цитокінів комплексно і аналізувати їх рівні в динаміці. Вважається, що провідну роль у розвитку генералізованого запального каскаду при сепсисі відіграють TNF-α і IL-1β.

Сучасним підходом терапії сепсису є цитокінотерапія ронколейкіном спільно з антибіотиками. При підшкірних ін'єкціях вводять в кожну точку не більше 0,25 мг препарату. Більшість хворих адекватно відповідають на терапію, що проводиться, і ніяких ускладнень не виникає. Лише у деяких хворих відзначається короткочасний озноб з нетривалим за часом підвищенням температури до 38-39 °С, помірний акроцианоз і легка ейфорія. Інших несприятливих явищ звичайно не спостерігається. Розвиток подібних реакцій свідчить про активацію цитокінової реактивності і є адекватною відповіддю імунної системи на введення рекомбінантного IL-2. У міру зниження мікробного навантаження макрофаги починають синтезувати IL-10 і розчинні рецептори TNF-α. Їх дія спрямована на придушення генералізованої запальної реакції. Через місяць після завершення курсу лікування спостерігається зниження продукції прозапальних цитокінів.

Аутоімунні захворювання (АІЗ) - це клас різнорідних за клінічними проявами захворювань, що розвиваються внаслідок патологічного вироблення аутоімунних антитіл або розмноження аутоагресивних клонів кілерних клітин проти здорових, нормальних тканин організму, що призводить до пошкодження і руйнування здорових тканин і до розвитку аутоімунного запалення. Головним у виникненні та розвитку АІЗ є розпізнавання власних структур організму імунокомпетентними клітинами як чужих і їх подальша активація, проліферація та індукція запалення. Прийнято вважати, що цитокіни є необхідними елементами розвитку АІЗ.

Ревматоїдний артрит - хронічне системне запальне захворювання сполучної тканини з прогресуючим ураженням переважно периферичних (синовіальних) суглобів за типом симетричного прогресуючого ерозивно- деструктивного поліартриту.

У розвитку ревматоїдного запалення важлива роль відводиться моноцитам і макрофагам. У синовіальній рідині і тканинах суглобів при ревматоїдному артриті міститься надмірна кількість TNF-α і IL-1 в при мінімальному вмісті Т-клітинних цитокінів (IL-2, -3 і -4, IFN-γ). TNF-a і IL-1 в можуть підсилювати експресію молекул адгезії на мембранах ендотелію судин синовіальної мембрани і їх лейкоцитарних лігандів, індукувати синтез хемотоксичних факторів (IL-8 і моноцитарний активуючий фактор), а також стимулювати продукцію фактора росту фібробластів і медіаторів запалення. TNF-α і IL-1 в активно синтезуються в синовіальній мембрані в основному клітинами моноцитарно-макрофагальної ряду. IL- 1β і TNF-α є потужними індукторами синтезу IL-6, який, впливаючи на гепатоцити, призводить до гіперпродукції гострофазових білків (С-реактивного, амілоїдного білків, фібриногену та ін.). IL-6 поряд з IL-1 в приймає участь у розвитку навколосуглобового остеопорозу. Велику роль в патогенезі ревматоїдного артриту відіграють мастоцити, які, виділяючи гістамін IL-4 і -6, стимулюють Т- і В-лімфоцити, а гепарин, що синтезується мастоцитами, активує макрофаги. Через IL-1 в і TNF-a здійснюється контакт мастоцитів клітин з синовіоцитами, проліферація яких у свою чергу супроводжується синтезом ПГ-Е2. Одночасно з цим відбувається активація ферментативних систем, що руйнують хрящ.

Зменшення вмісту TNF-α може модулювати апоптоз синовіальних клітин і гальмувати синовіальну гіперплазію. Нейтралізація TNF-α знижує концентрацію (зв'язує і пригнічує синтез) інтерлейкіну-1 (IL-1), IL-6, IL-8, моноцитарного хемоатрактантного білку-1, оксиду азоту, металопротеїназ (колагеназу, стромелізин) та інших індукторів запалення і тканинної деструкції, а також рівень розчинних форм молекул адгезії - ICAM-1 і E-селектину, що відображають активацію судинного ендотелію, чим досягається імунодепресивний ефект.

Додаткове призначення до хвороби-модифікуючих препаратів (метотрексат і сульфасалазин) антитіл до TNF-α (інфліксимаб, адалімумаб), розчинних рецепторів до TNF-α (етанерцепт) або імуномодуляторів, що знижують активність лімфоцитів (лефлуномід) асоційоване зі зниженням активності артриту, що характеризується зменшенням числа припухлих і хворобливих суглобів і поліпшенням суб'єктивного стану.

Астма. У формуванні імунної відповіді при запаленні, що спостерігається у хворих на астму, беруть участь імунні реакції 1, 3 і 4 типів, але частіше за інших провідну роль відіграє механізм 1 типу реакції. Визначення вироблення цитокінів мононуклеарами периферичної крові (МНПК) при стимуляції in vitro є більш адекватним у порівнянні з визначенням плазмового рівня цитокінів. При активації in vitro такими агентами, як фітогемаглютинин (PHA) і бактеріальний ліпополісахарид (LPS) у РТМЛ, МНПК секретують в культуральне середовище цілий спектр прозапальних цитокінів. Виражена спонтанна продукція цитокінів МНПК свідчить про те, що клітини вже активовані in vivo або in vitro в результаті опитів. Індукована продукція цитокінів дозволяє оцінити потенційні можливості активації клітин.

При дослідженні спонтанної та індукованої стандартними мітогенами (PHA і LPS E. coli) продукції цитокінів в супернатантах цільної крові було показано що:

1. Спонтанна продукція прозапального цитокіну IL-1β знижена в порівнянні з умовно здоровими, в той час як спонтанна продукція IL-1β у хворих на астму в стадії ремісії достовірно вища, ніж в стадії загострення.

2. При визначенні індексу співвідношення PHA-індукованої і LPS- індукованої продукції IL-1Р індекс значно нижчий в осіб з астмою в стадії загострення, ніж в стадії ремісії. Також ці результати значно нижчі в порівнянні з умовно здоровими особами.

3. Спонтанна продукція IL-10 достовірно вища в стадії загострення астми в порівнянні з хворими на астму в стадії ремісії і з групою умовно здорових.

4. Достовірне підвищення рівня IL-10 у хворих на астму в стадії загострення отримано і при PHA-індукованої і LPS-індукованої продукції IL-10 в порівнянні з двома іншими групами.

5. При підрахунку індексу співвідношення PHA-індукованої продукції IL-10 до спонтанної виявлено статистично достовірне зниження індексу при астмі в загостренні в порівнянні з умовно здоровою групою.

Отримані дані показують, що при астмі синтез і активація цитокінів залежить від фази захворювання. У стадії загострення спостерігається дисбаланс про- та протизапальних цитокінів, рівень протизапального IL-10 підвищується, його дія спрямована на процес загасання запалення.

Системний червоний вовчак. Важливе місце у розвитку СЧВ відводиться цитокінам. Продукція IL-10 при СЧВ значно збільшена, рівні IL-1β і TNF-α також підвищені при СЧВ, що корелює з активністю захворювання; продукція ауто-АТ до ДНК блокується АТ до IL-10.

Інфекційні захворювання. Відомо, що при ВІЛ-інфекції, крім пошкодження Т-клітинної ланки імунітету і поліклональній активації гуморальної ланки імунітету, спостерігаються порушення нормального балансу цитокінів та функціонування цитокінової мережі. В патогенезі ВІЛ-інфекції та СНІД дисбаланс цитокінів, що продукуються Тh1 і Th2, лімфоцитами і моноцитами, займає центральне місце, здійснює вплив на силу відповіді імунної системи на специфічні антигени вірусу. Цитокінова мережа задіяна практично на всіх етапах взаємодії вірус-клітина, розповсюдження ВІЛ в макроорганізму, формуванні імунодефіциту і розвитку опортуністичних інфекцій. На початковій стадії ВІЛ-інфекції відбувається підвищення рівня прозапальних цитокінів, які виступають в якості кофакторів активації ВІЛ. Дисбаланс цитокінів сприяє поразці вірусом СD4+ клітин, приводячи до прогресування імуносупресії і до подальшого розвитку опортуністичних інфекцій. Встановлено, що рівень TNF-α у хворих на ВІЛ-інфекцію значно підвищений, що полегшує реплікацію вірусу імунодефіциту. IL-10 і IL-1RA здатні знижувати реплікацію ВІЛ за рахунок інгібування продукції прозапальних цитокінів IL-1β і TNFα. У міру прогресування захворювання і переходу його у стадію СНІД спостерігається зсув у бік переважання IL-10: на стадіях III і IVAрівень інтерлейкіну знижений, далі йде тенденція до збільшення IL-10 в IVB стадії і достовірне збільшення даного цитокіну в стадії СНІДу (V стадії). Таким чином, патогенез ВІЛ-інфекції характеризується хронічною імунологічної дисфункцією, наслідком якої є гіперпродукція проза- пальних цитокінів. Об'єктивна оцінка сукупності параметрів, що характеризують ефективність протидії імунної системи організму та контролю реплікації ВІЛ може з певним ступенем достовірності визначити індивідуальний прогноз розвитку захворювання вже на ранніх стадіях асимптомних та ініціювати проведення інтенсивної попереджає терапії у осіб з несприятливим прогнозом.