ПІДРУЧНИК ІМУНОЛОГІЯ - Меркьюрі Поділля 2013

ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Лімфоцитотоксичний тест

До теперішнього часу в більшості лабораторій HLA-A. В, С і DR-антигени визначають за допомогою серологічних методів, зокрема, лімфоцитотоксичного тесту. Цей тест заснований на здатності анти-НLА-антитіл у присутності комплементу руйнувати лімфоцити, що несуть відповідні антигенні детермінанти. Загибель клітин демонструється за допомогою додавання трипанового синього. При цьому мертві, пошкоджені клітини фарбуються, і під мікроскопом вираховується їх кількість.

Мікролімфоцитотоксичний тест є модифікацією лімфоцитотоксичного тесту. Для його постановки використовують всього лише 1 мкл типуючих сироваток, а також невелика кількість клітин. Мікролімфоцитотоксичний тест є стандартним і використовується у всіх типуючих лабораторіях світу. Набір типуючих сироваток (типуюча панель) створюється в результаті досліджень із зразків сироваток, що містять анти- НLА-антитіла. Ці антитіла можуть індукуватися під час вагітності, при гемотрансфузіях, а також в результаті пересадки алотрансплантатів. Основними продуцентами типуючих сироваток є жінки, що багато народжували, які імунізуються HLA-продуктами чоловіка під час виношування плоду.

Для виявлення класичних антигенів системи HLA локусів А, В, С і DR використовується спеціальні антисироватки, що містять антитіла до вказаних антигенів. Найбільш поширеними є 2 види серологічних реакцій мікролімфоцитотоксичності для серологічного HLA-типування: 1) HLA-типування на планшетах Terasaki методом мікролімфоцитотоксичності (CDC) та 2) визначення HLAантигенів методом ELISA з використанням Lambda Monoclonal Trays.

1) Комплемент-залежний мікролімфоцитотоксичний тест Lambda Cell Tray™ (LCT™) призначений для скринінгу сироватки на наявність HLA антитіл I і II класу в комплемент-залежному лімфоцитотоксичному тесті. Набори Lambda Cell Tray™ 30Т, 60т і 72Т призначені для скринінгу і визначення специфічності HLA антитіл I класу. Набір Lambda Cell Tray™ 60В призначений для визначення специфічності HLA II класу.

Принцип методу. Лімфоцити, що несуть відомі антигени на поверхні, інкубують із зразком сироватки та кролячим комплементом. У разі, якщо сироватка містить специфічні антитіла до цих антигенів, запускається процес лізису клітини. Якщо дослідна сироватка містить HLA антитіла, то вони можуть бути визначені.

LCT™ Lambda Cell Tray™ являє собою заморожену клітинну панель, розроблену для визначення рівня PRA і скринінгу HLA антитіл. LCT™ пропонує різноманітну клітинну панель для цитотоксичного скринінгу антитіл в людській сироватці. Планшети складаються із заморожених в планшеті Терасакі відібраних лімфоцитів.

2) ELISA тест з використанням планшет Lambda Antigen Tray™ (LAT) Призначений для визначення HLA-специфічних антитіл в сироватці у реципієнтів до і після трансплантації. Характеризується високою специфічністю - в наборах LAT™ використані очищені антигени HLAI і II класу. Набір LAT™ розпізнає як цитотоксичні антитіла, так і антитіла не зв'язані з комплементом, дозволяє розрізнити специфічність HLAI і II класу, визначає IgG і IgM антитіла, включає антигени рідкісних алелів HLA.

Принцип методу LAT™ - це пре-калібровані реагенти ELISA для визначення IgG антитіл до молекул HLAI і II класів в людській сироватці. Певні кількості HLA антигенів, очищених методом афінної хромотографії, нанесені в різні лунки планшета Терасакі. Специфічне зв'язування антитіл з тестованого зразка з будь-яким з цих антигенів виявляють за допомогою антитіл, кон'югованих з лужною фосфатазою, які дізнаються тільки людські IgG. Кількісні визначення ступеня реакції визначають спектрофотометрично, після додавання відповідного хромогенного субстрату. Якісні визначення специфічності антитіл визначають шляхом аналізу LAT™ карти реактивності з використанням відповідних LAT™ робочих таблиць.

LAT™ планшети з антигенами Lambda (Lambda Antigen Trays™, LAT™) є очищені комплекси HLA класу I і II, нанесені на планшети Терасакі, і призначені для визначення HLA IgG антитіл. При додаванні сироватки пацієнта, антитіла зв'язуються з очищеними HLA антигенами. Панель HLA антигенів дозволяє реєструвати зв'язаний і не зв'язаний комплемент IgG антитіла.

LAT™ Mixed метод з використанням планшетів зі змішанням анти- генами-метод попереднього скринінгу HLA антитіл, який дозволяє тестувати кілька зразків на одному планшеті. Планшети LAT™ Mixed містять певний набір HLA антигенів, включаючи рідкісні, і розпізнає як цитотоксичні антитіла, так і антитіла, що не зв'язуються з комплементом.

LAT™ Single Antigen метод з використанням одного антигену - це метод для реєстрації та визначення типу HLA антитіл в пацієнтах з високим рівнем PRA. Всі лунки планшет Терасакі для LAT™ Single Antigen покриті однаковими антигенами. LAT™ SingleAntigen визначає антитіла зі слабкою специфічністю, які можуть бути не виявленими іншими методами на тлі антитіл проти антигенів, що представлені в більшій кількості. За допомогою панелі очищених антигенів HLA точно ідентифікується специфічність антигенів у сироватці з високим рівнем PRA.