ПІДРУЧНИК ІМУНОЛОГІЯ - Меркьюрі Поділля 2013

ПРИРОДЖЕНА ІМУННА НЕДОСТАТНІСТЬ

Дослідження клітинного імунітету

Дослідження поверхневих антигенів T-лімфоцитів. Визначення поверхневих антигенів T-лімфоцитів за допомогою проточної цитофлюориметрії дозволяє вивчити їх дозрівання, диференціювання і активацію.

Стимуляція T-лімфоцитів in vitro. Порушення дозрівання і диференціювання T-лімфоцитів при імунодефіцитах з недостатністю клітинного імунітету відбуваються на різних рівнях. Так, при важкому комбінованому імунодефіциті порушується дозрівання T-лімфоцитів у тимусі, що виявляється відсутністю на поверхні T-лімфоцитів антигену CD2. При цьому захворюванні також можливі відсутність CD3, CD4 і нездатність T-лімфоцитів синтезувати цитокіни. При синдромі голих лімфоцитів на мембрані активованих T-лімфоцитів відсутні антигени MHC класу II. При синдромі Віскотта-Олдріча понижена експресія антигену CD43, що бере участь в активації T-лімфоцитів. Важкі імунодефіцити з недостатністю клітинного імунітету супроводжуються вираженим порушенням функції T-лімфоцитів, хоча абсолютне і відносне число цих клітин може бути нормальним.

Реакція бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ). Під дією мітогенів, антигенів і алогенних клітин B-лімфоцити, які знаходяться в стані спокою, активуються, перетворюються на бластні клітини і починають ділитися. Спонтанна проліферація лімфоцитів (бласттрансформація) буває підвищена у хворих, що перенесли багатократні переливання крові, хворих алергічними і автоімунними захворюваннями, при бактерійних і вірусних інфекціях, а також у новонароджених.

Змішану культуру лімфоцитів застосовують для оцінки здатності T- лімфоцитів розпізнавати антигени HLA алогенних В-лімфоцитів і моноцитів. Стимулюючі клітини (алогенні В-лімфоцити) інактивуються опромінюванням або мітоміцином. Реакція лімфоцитів хворого оцінюється за включенням у ДНК міченого тимідину.

Біохімічні дослідження. При підозрі на комбіновану недостатність гуморального і клітинного імунітету визначають активність аденозиндезамінази і пуріннуклеозидфосфорілази (беруть участь у метаболізмі нуклеозидів). При атаксії-телеангіоектазії майже завжди підвищений рівень альфа-фетопротеїну в сироватці, що дозволяє диференціювати це захворювання з іншими нервовими хворобами. До рідкісних метаболічних порушень, що супроводжуються недостатністю клітинного імунітету, відносяться оротова ацидурія і біотин-залежна недостатність карбоксилази (виявляється алопецією і неврологічними порушеннями). При недостатності транскобаламіну II (бере участь у транспорті вітаміну B12) уражаються тканини, що швидко оновлюються, тому для цього захворювання характерні недостатність гуморального імунітету, порушення кровотворення (анемія, тромбоцитопенія), пронос і відставання у розвитку.

Генетичні дослідження. У хворих з важкою недостатністю клітинного імунітету можливий химеризм (існування клітин різних генотипів у одному організмі). Він виникає при попаданні материнських клітин крові у кров плоду, переливання компонентів крові і трансплантації кісткового мозку. Якщо у крові хворого містяться клітини людини протилежної статі, химеризм легко виявити, виявивши клітини з жіночим і чоловічим каріотипами. У решті випадків проводять типування клітин крові хворого за HLA. Це дослідження також дозволяє виявити від сутність антигенів HLA класу II на активованих T-лімфоцитах при синдромі голих лімфоцитів.

Скануюча електронна мікроскопія виявляє T-лімфоцити, на поверхні яких немає мікроворсинок, що характерне для синдрому Віскотта-Олдріча.

Біопсія тимусу проводиться у ряді випадків для підтвердження діагнозу важкого комбінованого імунодефіциту. При недостатності клітинного імунітету у тимусі визначаються скупчення ретикуло-епітеліальних клітин, відсутність телець Гассаля і чіткої межі між кірковою і мозковою речовиною, різке зниження числа тимоцитів.

Біопсія лімфовузлів. При недостатності клітинного імунітету у біоптаті лімфовузла виявляється спустошення паракортикальної зони. Із-за ризику попадання інфекції через рану і ускладнень анестезії біопсію лімфовузлів проводять тільки у тому випадку, коли інші лабораторні дослідження не дозволяють підтвердити діагноз.

Дослідження фагоцитозу показане при хронічних і рецидивуючих бактерійних інфекціях, якщо дослідження гуморального і клітинного імунітету не виявило відхилень від норми. Недостатність фагоцитів може бути обумовлена порушенням міграції, хемотаксису, адгезії фагоцитів, а також порушенням власне фагоцитозу. Крім того, недостатність фагоцитів може бути обумовлена дефіцитом опсонінів (антитіл і комплементу) і порушенням метаболізму фагоцитів.

Тест відновлення нітросинього тетразолія застосовується у діагностиці хронічної гранулематозної хвороби. Суть методу полягає у наступному: до фагоцитів додають жовтий фарбник нітросиній тетразолій, у нормі при його поглинанні метаболічна активність фагоцитів зростає, нітросиній тетразолій відновлюється, продукти цієї реакції забарвлені у синій колір. Про порушення метаболізму фагоцитів судять по зниженню інтенсивності синього фарбування. При виявленні порушень визначають рівень цитохрому b558 та інших білків фагоцитів.

Хемілюмінесценція також дозволяє оцінити функціональну активність фагоцитів. У нормі при фагоцитозі з'являється велика кількість вільних радикалів кисню, що окисляють субстрат, наприклад компоненти клітинної стінки бактерій. Окислення супроводжується випромінюванням видимого або ультрафіолетового світла. По інтенсивності випромінювання можна судити про функціональну активність фагоцитів.

Оцінка фагоцитарної активності - найбільш інформативний спосіб дослідження опсонінів і функціонального стану фагоцитів. У нормі протягом 2 год. фагоцитами поглинається і руйнується близько 95% бактерій. При хронічній гранулематозній хворобі число зруйнованих бактерій не перевищує 10%, а всередині лейкоцитів виявляються життєздатні бактерії. Присутність живих бактерій у лейкоцитах при інкубації з сироваткою здорової людини свідчить про порушення переварювання бактерій у відсутність зниження здатності до захоплення бактерій. Підвищений вміст життєздатних бактерій в надосадовій рідині при інкубації з сироваткою хворого свідчить про дефіцит опсонінів.

Хемотаксис лейкоцитів. Порушення хемотаксису може бути обумовлене дефектом фагоцитів, наявністю інгібіторів хемотаксису, дефіцитом сироваткових або тканинних чинників хемотаксису.

Для дослідження хемотаксису лейкоцитів застосовують метод шкірного вікна. Дослідження хемотаксису in vitro засноване на стимуляції виділених з крові фагоцитів чинниками хемотаксису. Здатність фагоцитів до направленої міграції можна оцінити, помістивши їх у камеру Бойдена або чашку Петрі з агарозою.

Адгезія лейкоцитів. Порушення адгезії лейкоцитів обумовлена зниженням експресії або відсутністю на їх поверхні молекул адгезії, наприклад CD11/CD18. Для визначення молекул адгезії застосовують проточну цитофлюоріметрію. Відсутність CD11/CD18 на нейтрофілах і моноцитах виявляється пізнім відпаданням пуповини, рецидивуючими бактерійними інфекціями, пародонтитом.

Діагностика аспленії. Селезінка грає важливу роль у захисті від інфекції, оскільки містить величезну кількість макрофагів і плазматичних клітин. У хворих з аспленією часто спостерігається сепсис, у мазках крові виявляються деформовані еритроцити і тільця Говерла-Жоллі. Аспленію виявляють за допомогою ультрасонографії.

Інші дослідження. Визначення активності мієлопероксидази, глутатіонпероксидази, лізоциму, глюкозо-6-фосфат-дегідрогенази, піруваткінази і електронну мікроскопію проводять для виявлення незначних порушень функцій фагоцитів і у наукових цілях. При нейтропенії показані повторні визначення числа лейкоцитів у крові, визначення числа лейкоцитів у крові після введення кортикостероїдів, адреналіну і ендотоксину, визначення антитіл до лейкоцитів, дослідження кісткового мозку.

Дослідження кісткового мозку проводять при стійкій лейкопенії або лейкоцитозі, зміні морфології лейкоцитів, виявленні бластних форм у крові.

Пренатальна діагностика і генетичне консультування. На сьогоднішній день встановлено, що багато імунодефіцитів є спадковими захворюваннями: відомий тип їх успадкування, виявлена локалізація дефектного гена, визначений продукт цього гена (табл. 49). В даний час стало можливим виявлення носійства дефектного гена. Так, гетерозиготне носійство дефектного гена, що кодує який-небудь фермент, можна виявити по зниженню активності цього ферменту, наприклад при автосомно-рецесивному важкому комбінованому імунодефіциті понижена активність аденозиндезамінази, при хронічній гранулематозній хворобі - ферментів дихального ланцюга, при X-зчепленій агамаглобулінемії - тирозинкінази у В-лімфоцитах. Виявлений також цілий ряд дефектів, не пов'язаних з порушенням синтезу ферментів, наприклад при X-зчепленому важкому комбінованому імунодефіциті - порушений синтез гамма-ланцюга рецептору до інтерлейкіну-2, синдромі гіперпродукції IgM - синтез глікопротеїду клітинної мембрани gp39, ліганду рецептора CD40 В-лімфоцитів. У дівчаток з X-зчепленими імунодефіцитами, що виявляються порушенням диференціювання лімфоцитів (X- зчеплена агамаглобулінемія, X-зчеплений важкий комбінований імунодефіцит, синдром Віскотта-Олдріча), у крові виявляються як диференційовані, так і недиференційовані лімфоцити. Це обумовлено тим, що Х-хромосома, що несе дефектний ген, інактивована лише у частині клітин. Наявність недиференційованих лімфоцитів у відсутність клінічних проявів цих імунодефіцитів указує на носійство дефектного гена. Аналіз поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів також дозволяє виявити носіїв дефектного гена у сім'ї.

Таблиця 49. Спадкові імунодефіцити з встановленими генними мутаціями

Захворювання

Дефект

Дефектний білок

Диференціровка лімфоцитів

Тяжкий комбінований ІД (ТКІД)

Відсутність Т- и В-клітин

RAG-1, RAG-2 (recombination activating genes - гени рекомбіназ)

ТКІД, зчеплений з Х-хромосомою

Відсутність Т- та NK-клітин

IL-2Rγ

агамаглобулінемія, зчеплена з Х-хромосомою

Відсутність В-клітин

Btk (Bruton’s tyrosine kinase)

Представлення антигену

Порушення експресії гена HLA-II

Низький рівень CD4+

CIITA (class II transactivator) RF-X (промотерний білок)

Порушення експресії гена HLA-I

Низький рівень CD8+ та NK-клітин

ТАР2 (транспортний білок, асоційований з процесінгом антигену)

Активація лімфоцитів

Дефект TCR

Порушення Т-клітинної активації

CD3γ, CD3ε-мутація

Гіпер-IgE синдром

Порушення переключання синтезу IgE

CD40L

Контроль клітинної загибелі

Fas-дефіцит

Проліферація лімфоцитів Аутоімунітет

Fas

Метаболічні дефекти

Дефіцит аденозиндезамі- нази

Лімфопенія

Мутація ADA гену

Дефіцит пуріннуклеозид- фосфорілази

Т-клітинна лімфоцитопенія

Мутація PNP гену

Клітинна адгезія фагоцитів та генерація кисневого вибуху

Дефіцит адгезії лейкоцитів

Порушення адгезії лейкоцитів

СD18 дефіцит

Інші захворювання

С-м Віскотта-Олдріча

Дефект лімфоцитів і тромбоцитів

WASP-білок

Атаксія-телеангіектазія

Пошкодження ДНК

ATM-ген

Лабораторні методи пренатальної діагностики засновані на дослідженні клітин пуповинної крові і навколоплідних вод, а також ворсин хоріону. Так, при всіх формах важкого комбінованого імунодефіциту в пуповинній крові відсутні T-лімфоцити, при синдромі Віскотта-Олдріча виявляються тромбоцитопенія і T-лімфоцити, що позбавлені мікроворсинок. У табл. 49 вказаний тип успадкування і можливість застосування генетичних методів для діагностики деяких первинних імунодефіцитів.