МИКРОБИОЛОГИЯ Учебное пособие - 2012

ГЛАВА 7. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА МИКРООРГАНИЗМЫ

В естественной среде микроорганизмы подвергаются воздействию разных по своей природе факторов. Влияние этих факторов может либо стимулировать развитие микроорганизмов, либо вызывать торможение роста и метаболизма, либо способствовать гибели клеток. Действие мутагенных факторов приводит к изменению наследственных признаков микроорганизмов. Условно факторы внешней среды можно разделить на физические, химические и биологические.

В пищевой промышленности для сохранения продовольственных продуктов используют методы консервирования, основанные на подавлении жизнедеятельности микроорганизмов физическими или химическими факторами.

7.1. ФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

К наиболее важным физическим факторам относятся влажность, температура, лучистая энергия, ультразвук, токи сверхвысокой частоты (СВЧ).

Температура. Температура окружающей среды определяет не только скорость размножения микроорганизмов, но и саму возможность их существования. Жизнедеятельность каждого организма имеет определенные температурные границы. Эту температурную зависимость выражают тремя кардинальными точками.

Минимальная — низшая температура, при которой еще может происходить рост микроорганизмов определенного вида и ниже которой их размножение прекращается.

Оптимальная — это температура, при которой микроорганизмы размножаются с максимальной скоростью, а лаг-фаза перед ростом минимальна.

Максимальная — это температура, выше которой начинаются повреждения клетки, приводящие к ее гибели.

По отношению к температуре микроорганизмы условно подразделяют на три группы: психрофилы или холодолюбивые (от греч. psychria — холод, phileo — люблю); мезофилы (от греч. mesos — средний) и термофилы (от греч. therme — тепло, жар).

Психрофилы хорошо растут при относительно низких температурах, их оптимальная температура роста около 10—15 °С (табл. 4). Диапазон температур, при котором могут размножаться психрофилы, лежит в пределах от —10 до +20 °С. Психрофилами являются обитатели холодных источников, северных морей и океанов, глубоких озер. К психрофилам относится большинство светящихся бактерий (род Photobacterium). Их культуры излучают белое, зеленовато-лунное или голубое свечение. Способность психрофилов расти при низких температурах объясняют особенностями строения их ферментных белков и мембранных липидов. В составе последних содержится повышенное количество ненасыщенных жирных кислот, что позволяет мембранам находиться при низких температурах в активном жидкостно-кристаллическом состоянии.

Отмирание микроорганизмов при низких температурах возможно вследствие их старения или голодания во время длительного нахождения в состоянии анабиоза. При температуре ниже 0 °С разрушающее действие на клетку оказывают кристаллы льда и повышенное осмотическое давление, создающееся в клетке при замерзании воды.

Мезофилы имеют температурный оптимум 30—40 °С. К ним относится большинство сапрофитных и патогенных бактерий. Например, кишечная палочка Escherichia coli относится к типичным мезофилам: ее оптимальная температура роста 37 °С, нижняя граница роста — +10 °С, а верхняя — +49 °С.

Термофилы составляют достаточно обширную и разнообразную группу микроорганизмов, растущих при относительно высоких температурах. Их температурный оптимум находится в диапазоне 50—65 °С. Термофилы широко распространены в природе: обнаруживаются в горячих водных источниках, в торфе, навозе, в сооружениях по биологической очистке сточных вод. Сравнительно недавно обнаружены экстремальные термофилы, температурный оптимум которых лежит выше 70 °С. Они выделены из илов и воды горячих источников и отнесены к родам Thermus, Thermobacterium и др.

Таблица 4. Температурные интервалы роста микроорганизмов

Охлаждение и замораживание пищевых продуктов является широко распространенным способом предохранения их от микробной порчи. Продукты охлаждают и хранят при температуре (10...—2) °С, замораживают до температуры от —12 до —30 °С. Охлаждение продуктов позволяет сохранить их натуральные свойства, однако размножение микроорганизмов в них не исключается, а лишь замедляется. Поэтому сроки хранения продуктов в охлажденном состоянии ограничены. Они зависят от температуры хранения и исходной микробной обсемененности продукта психротрофными и психрофильныим микроорганизмами. Например, Micrococcus cryophilus имеет оптимальную температуру размножения 10 °С и может расти даже при — 4 °С Pseudomonasputida — при —2 °С, Pseudomonas fluorescens — при +5 °С. Высокой холодоустойчивостью обладают мицелиальные грибы родов Mucor, Thamnidium, Cladosporium, Alternaria. Они могут размножаться на пищевых продуктах при температуре от 0 до —5 °С.

Охлаждают молоко и молочные продукты, мясо, рыбу, птицу, овощи, фрукты и др. Для увеличения сроков хранения охлажденных продуктов используют дополнительные факторы воздействия на микроорганизмы: ультрафиолетовое облучение (например, перед упаковкой мясных полуфабрикатов), вакуумную упаковку, озонирование, изменение состава газовой среды.

При замораживании в микробной клетке образуются кристаллы льда, вызывающие механическое повреждение клеточных мембран и последующую гибель клеток. Поэтому часть микроорганизмов погибает уже в процессе замораживания, причем при низкой скорости замораживания процент гибели клеток значительно выше, чем при высокой скорости замораживания. Тем не менее часть микроорганизмов выживает, но находится в состоянии анабиоза.

При хранении продуктов в замороженном состоянии большинство находящихся на продуктах микроорганизмов отмирает; при этом чем ниже температура хранения, тем медленнее происходит их гибель.

Замораживают мясо, рыбу, птицу, творог, плоды, ягоды, овощи, тесто, различные кулинарные полуфабрикаты. При размораживании продуктов следует учитывать, что некоторые микроорганизмы, находящиеся в состоянии анабиоза, после оттаивания начинают размножаться, поэтому размороженные продукты следует быстро подвергнуть кулинарной обработке или сразу употребить.

При температурах, превышающих максимальную, уменьшается ферментативная активность, нарушаются метаболические процессы в клетке, скорость роста микроорганизмов резко снижается. Дальнейшее повышение температуры приводит к необратимым процессам: денатурации белков цитоплазмы, инактивации ферментов, что в конечном итоге ведет к гибели клетки.

С целью предохранения пищевых продуктов от микробной порчи в пищевой промышленности используют два способа тепловой обработки — пастеризацию и стерилизацию.

Пастеризацией называют нагревание продукта в диапазоне температур (65—95) °С. Продолжительность пастеризации зависит от вида продукта, его массы, теплоемкости, температуры и длится от нескольких секунд до 10—30 мин. Пастеризации подвергают, как правило, жидкие продукты: пиво, вино, молоко, сливки и др. При пастеризации погибают не все микроорганизмы; остаточную микрофлору пастеризованных продуктов составляют некоторые термоустойчивые бактерии и споры бактерий.

Стерилизацией называют полное освобождение пищевых продуктов от живых микроорганизмов и их покоящихся форм. Стерилизацию пищевых продуктов обычно осуществляют под давлением с помощью влажного жара и проводят в автоклавах.

Традиционно тепловая обработка пищевых продуктов включает в себя нагревание до заданной температуры, выдержку продукта при этой температуре и охлаждение до определенной температуры. Наибольшим бактерицидным эффектом обладает насыщенный водяной пар под давлением. При стерилизации паром время гибели спор наиболее устойчивых термофилов при 121 °С составляет 4 мин, тогда как при использовании сухого жара время их гибели при 160⁰С составляет 60 мин, а при 180 °С — 10 мин. Гибель микроорганизмов под действием высоких температур происходит в результате коагуляции белков. Важное значение при этом имеет содержание воды в клетке: чем больше воды, тем ниже температура коагуляции белков. Именно этим объясняется высокий стерилизующий эффект насыщенного водяного пара; он не только нагревает, но и дополнительно увлажняет клетки, что повышает их термочувствительность.

Влажность. Микроорганизмы могут размножаться только в субстратах, имеющих свободную воду и не ниже определенного уровня. В среде, лишенной влаги, прекращается питание микроорганизмов, так как питательные вещества могут транспортироваться в клетку только в растворенном состоянии. Потребности микроорганизмов в воде можно выразить количественно в форме активности воды (a_w).

Активность воды определяется отношением давления пара раствора к давлению пара дистиллированной воды:

где Р — давление водяного пара раствора; Р₀ — давление пара чистой воды.

Для дистиллированной воды a_w = 1.

Размножение многих микроорганизмов наблюдается при a_w субстрата в диапазоне от 0,99 до 0,65. Большинство бактерий размножается при активности воды субстрата не ниже 0,95—0,90; для дрожжей предельная величина a_w — 0,88—0,80; плесени могут размножаться, хотя и медленно, при a_w субстрата 0,75—0,65. Следовательно, продукты, активность воды которых меньше 0,7, могут определенное время сохраняться без микробной порчи (табл. 5).

Таблица 5. Активность воды и рост микроорганизмов в пищевых продуктах (Fennema, 1985)

Снижение a_w субстрата может быть достигнуто либо частичным удалением из него воды, либо добавлением растворимых веществ.

По отношению к влажности субстрата микроорганизмы условно подразделяют на гидрофиты («влаголюбивые» — растущие при высоких значениях влажности субстрата и плохо переносящие высушивание), мезофиты (способные расти при средних значениях влажности субстрата) и ксерофиты («сухолюбивые» — способные расти при низких значениях влажности субстрата и хорошо переносящие высушивание).

В процессе высушивания микробов вода перемещается от центра клетки к ее периферии. Вместе с водой перемещаются растворенные в воде вещества, и благодаря проницаемости клеточной стенки они выходят из клетки. В то же время периферийные участки клетки, прилегающие к цитоплазматической мембране, насыщаются растворенными в воде клеточными веществами: углеводами, аминокислотами, витаминами. Повышение концентрации этих веществ может привести к коагуляции или даже денатурации белка и инактивации некоторых ферментов. Инактивация ферментов и потеря клетками жизнеспособности во время высушивания может также произойти в результате сахароаминных реакции, протекающих между карбонильной группой глюкозы и свободными аминогруппами белков клетки.

Высушивание бактерий приводит к обезвоживанию цитоплазмы клетки, почти полному прекращению процессов метаболизма и в конечном итоге к переходу микробной клетки в состояние анабиоза. В этом состоянии у микроорганизмов обмен веществ практически сведен до минимума. Микроорганизмы могут сохранять свою жизнеспособность в высушенном состоянии довольно длительный период времени. Устойчивость к высушиванию у разных микробов различна. Так, гонококки и холерный вибрион переносят высушивание в течение 2 дней, туберкулезная палочка — в течение 90 дней, многие стафилококки и микрококки могут сохраняться в сухом виде в течение нескольких недель или месяцев, высушенные молочнокислые бактерии и многие дрожжи сохраняют жизнеспособность несколько месяцев и даже лет. Особенно устойчивы к высушиванию покоящиеся формы микроорганизмов — споры и цисты бактерий, которые сохраняют жизнеспособность в течение десятков, сотен лет и даже тысячелетий.

Для сохранения производственных и музейных культур микроорганизмов используют высушивание методом сублимации (замораживание и высушивание в условиях вакуума).

Сушка. Для предохранения пищевых продуктов от микробной порчи используют старый и широко распространенный способ консервирования путем сушки, основанный на способности микроорганизмов размножаться при определенной влажности среды (обычно не менее 10 %). В высушенном виде хранят зерно, муку, макаронные и хлебобулочные изделия, молоко и молочные продукты, овощи, фрукты, грибы, мясо, рыбу и др.

Для сохранения высушенных продуктов без порчи большое значение имеет относительная влажность воздуха. Сухие продукты, в связи со своей гигроскопичностью, могут отдавать или поглощать воду. При этом между влажностью воздуха и продукта устанавливается равновесное состояние. Влагосодержание продукта, равновесное 70 %-ной относительной влажности воздуха, является нижним «критическим» пределом, до которого возможен рост микроорганизмов. Бактерии способны размножаться в субстратах с влажностью, равновесной относительной влажности воздуха 95—90 %. Для дрожжей эта величина составляет 90—85 %, для плесневых грибов 75—80 %, а для некоторых устойчивых к высушиванию видов микроорганизмов — 75—65 %.

Таким образом, возможность развития микроорганизмов в продуктах зависит как от влажности субстрата, так и от относительной влажности воздуха. Хранение и транспортировка высушенных продуктов должны осуществляться в условиях, предупреждающих изменение их влажности.

Концентрация растворенных веществ. Жизнедеятельность микроорганизмов в большой степени зависит от осмотического давления среды, которое определяется концентрацией растворенных в ней веществ. В естественных условиях микроорганизмы адаптировались к существованию в средах с определенным осмотическим давлением, поэтому внутриклеточное давление у многих микроорганизмов колеблется в широких пределах — от нескольких десятых долей мегапаскалей до нескольких десятков МПа. От величины осмотического давления зависят активность воды и поступление ее в клетку. Чем выше осмотическое давление, тем ниже активность воды (a_w) и тем менее она доступна для клетки.

Осмотическое давление внутри клеток многих бактерий соответствует давлению 10—20 %-ного раствора сахарозы. Высокое осмотическое давление внутри клетки способствует постоянному притоку воды, вследствие чего коллоиды набухают и цитоплазма плотно прилегает к клеточной стенке. Такое состояние цитоплазмы называется тургором. Если бактерии поместить в раствор с более высоким осмотическим давлением, то вода выходит из клетки и объем цитоплазмы уменьшается, что сопровождается повреждением мембраны и гибелью клетки. Это явление называется плазмолизом. У грамположительных бактерий мембрана отстает от клеточной стенки. У грамотрицательных бактерий клеточная стенка отстает от содержимого клетки вместе с мембраной, что также вызывает повреждение мембраны и потерю клеткой жизнеспособности. В том случае, когда раствор имеет более низкое давление, вода будет поступать внутрь клетки, и ее гибель произойдет в результате разрыва клеточной стенки — плазмоптиз.

Благодаря наличию ригидной клеточной стенки большинство бактерий мало чувствительны к изменениям концентрации солей в пределах 0,5—3,0 %, однако повышение их содержания в среде свыше 4 % приводит к подавлению роста гнилостных, молочнокислых, пропионовокислых и некоторых других бактерий.

Консервирующее действие повышенного осмотического давления за счет добавления сахара, хлорида натрия широко используется в пищевой промышленности при производстве сгущенного молока, варенья, джемов, различных фруктовых сиропов, а также при посоле мяса, рыбы, овощей, грибов.

Наряду с микробами, чувствительными к изменению осмотического давления, известен ряд микроорганизмов, которые нормально размножаются при высоком осмотическом давлении. Такие микроорганизмы называют осмофильными. Например, некоторые дрожжи размножаются в меде, микрококки — в сгущенном молоке.

Осмофильные микроорганизмы, нормально размножающиеся в растворах с высокой концентрацией хлорида натрия, называются галофильными (любящими соль). Эти микроорганизмы обитают в соленых морях, озерах, минеральных источниках. Галофильные микроорганизмы — бактерии родов Halobacterium, Sarcina, Micrococcus — являются возбудителями порчи соленых продуктов (рыбы, солонины, бекона).

Несмотря на то что повышение осмотического давления среды за счет добавления поваренной соли или сахара предохраняет продукты от микробной порчи, многие находящиеся в них микроорганизмы, в том числе возбудители ряда пищевых отравлений и заболеваний, не погибают; приостанавливается лишь их жизнедеятельность. Так, при хранении соленой рыбы в ней могут присутствовать солеустойчивые стафилококки, а также палочка ботулизма — возбудители токсикозов. В результате размножения осмофильных дрожжей и плесеней происходит порча (плесневение, забраживание) варенья, джема, повидла, фруктовых сиропов. Осмотолерантные микроорганизмы способны размножаться в средах с широко варьируемым осмотическим давлением. Эта особенность у бактерий объясняется тем, что внутриклеточное осмотическое давление в каждом случае превышает осмотическое давление среды. Главную роль в такой регуляции играет накопление внутри клетки ионов калия (К⁺). Показано, что многие бактерии концентрируют К⁺ гораздо в большей степени, чем Na⁺. Таким образом, существует четкая корреляция между осмотолерантностью бактерий и содержанием в них К⁺.

Лучистая энергия распространяется в пространстве в виде электромагнитных волн разной длины. Наибольшее действие на микроорганизмы оказывают световая энергия и ионизирующие излучения.

Солнечный свет необходим только для жизнедеятельности фотосинтезирующих микроорганизмов: зеленых, сине-зеленых и пурпурных бактерий, клетки которых содержат пигменты. Все прочие прокариоты предпочтительнее размножаются в темноте. Однако развитие многих мицелиальных грибов в темноте протекает ненормально: при постоянном отсутствии света хорошо размножается только мицелий, а спорообразование тормозится.

Ультрафиолетовое облучение может вызывать гибель клеток микроорганизмов или мутации. Наибольшей фотохимической активностью обладают ультрафиолетовые лучи с длиной волны 100—400 нм. Сильным мутагенным и бактерицидным эффектом обладают УФ-лучи с длиной волны 250—260 нм. Поглощение их сопровождается образованием димеров тимина в молекуле ДНК, что в свою очередь подавляет репликацию ДНК и приводит к прекращению деления микробной клетки. Повреждающее действие УФ-облучения частично снимается при облучении культур видимым светом. Это явление получило название фотореактивации. По-видимому, фотореактивация обусловлена действием ферментов, расщепляющих аномальные димеры тимина.

Среди неспорообразующих бактерий наиболее устойчивы к УФ-облучению пигментные кокки, у которых пигмент находится в цитоплазме (сарцины, стафилококки); наименее устойчивы — пигментные бактерии, выделяющие пигмент во внешнюю среду.

В настоящее время УФ-лучи широко применяют на практике при стерилизации воздуха операционных и родильных отделений, заквасочных помещений, холодильных камер. Стерилизация пищевых продуктов с помощью УФ-лучей затруднена в связи с их низкой проникающей способностью. Действие этих лучей проявляется только на поверхности или в очень тонком слое. УФ-облучение охлажденных продуктов (например, мясных полуфабрикатов) перед асептической упаковкой удлиняет сроки их хранения.

Рентгеновские лучи с длиной волны менее 10 нм обладают наибольшей проникающей способностью. Продукты ядерного распада — α-частицы, β-частицы и γ-лучи (коротковолновые рентгеновские лучи) различаются проникающей способностью. Наименьшая активность, но и наибольшая проникающая способность установлена у γ-лучей. Губительное действие ионизирующих излучении на микроорганизмы объясняется ионизацией внутриклеточных структур. Эффект ионизирующего излучения зависит от его дозы и продолжительности воздействия. Возникающие фотохимические изменения сопровождаются мутацией или гибелью клетки. Однако среди прокариот известны отдельные виды бактерии, обладающие высокой устойчивостью к действию рентгеновских лучей. Это тионовые бактерии, а также Micrococcus radiodurans, выделяемые из воды атомных реакторов.

В пищевой промышленности ионизирующее облучение используют для стерилизации упаковочного материала из полистирола.

Ультразвук — это высокочастотные колебания звуковых волн с частотой более 20 кГц, не воспринимаемой ухом человека. Ультразвуковые волны могут вызвать разрывы клеток и клеточных структур, а также их морфологические, функциональные и физико-коллоидные изменения. Под влиянием ультразвука в цитоплазме микробных клеток образуется полое пространство — кавитационный пузырек, который заполняется парами жидкости. В пузырьке возникает высокое давление, достигающее десятков или сотен мегапаскалей, что приводит к разрушению (дезинтеграции) цитоплазматических структур клетки или разрыву самой клетки. Кроме того, развитие кавитации сопровождается возникновением электрического поля высокого напряжения. Свободно двигающиеся электрические заряды вызывают ионизацию молекул, в результате чего появляются ненасыщенные, реакционно способные продукты расщепления воды, оказывающие губительное действие на клетку или вызывающие изменение функциональных свойств.

Бактерицидное действие ультразвука зависит от его интенсивности и продолжительности воздействия. Устойчивость микроорганизмов к действию ультразвука зависит от их размеров, формы, способности образовывать эндоспоры: чем меньше размеры клетки, тем выше ее устойчивость к действию ультразвука; палочковидные формы погибают быстрее, чем шаровидные; споры более устойчивы, чем вегетативные клетки.

Токи сверхвысокой частоты. Электромагнитные излучения СВЧ оказывают тепломеханическое воздействие на микробные клетки, вызывая их гибель. Это обусловлено селективным выделением теплоты непосредственно в микробной клетке. Гибели микробов способствует также то, что максимальная напряженность поля создается на границе раздела клетки и окружающей среды.

На эффективность бактерицидного действия токов СВЧ существенно влияет скорость нагрева. Увеличение скорости нагрева приводит к снижению бактерицидного действия токов СВЧ. Например, при скорости СВЧ-нагрева 0,5 и 1,0 °С/с кишечная палочки погибает при 65 °С, тогда как при нагреве со скоростью 4,0 и 6,0 °С/с клетки данного вида погибают только при 70 °С.

В отличие от обычных способов тепловой обработки при СВЧ-нагреве пищевых продуктов не проявляются теплозащитные свойства белков, жиров и других веществ, так как электромагнитная энергия аккумулируется непосредственно микробной клеткой. Поэтому при СВЧ-нагревании отмирание микроорганизмов происходит быстрее и при менее высоких температурах, что позволяет снизить температуру тепловой обработки и улучшить качество продуктов питания. Токи СВЧ применяют для тепловой обработки только в стеклянной таре, так как через металл они не проникают.