Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Рестрикция ДНК
Рестрикция плазмидной и фаговой ДНК

Активность и количество фермента. Каждый препарат фермента обладает определённой активностью. 1 единица активности рестриктазы полностью гидролизует 1 мкг ДНК фага λ за 1 ч при 37°С. Коммерческие препараты обычно имеют активность 10-20 ед/мкл и требуют разведения. Гидролиз ДНК осуществляют 2-3-кратным избытком фермента, т.е. на 1 мкг ДНК берут 2-3 единицы. Хранят рестриктазы при -20°С в 50% глицерине.

Буферы. Абсолютно необходимым кофактором для работы рестриктазы являются ионы Mg²⁺. Буферную ёмкость с нужным значением показателя pH обеспечивает Tris-HCl. ß-меркаптоэтанол или дитиотрейтол стабилизирует фермент. Различают высокосолевой (100мМ NaCl), среднесолевой (50мМ NaCl) и низкосолевой (без NaCl) буферы. Фирмы-поставщики вместе с ферментом продают и необходимый буфер в концентрированном виде.

Объём реакционной смеси. Удобно проводить рестрикцию в объёме 20-50 мкл, когда раствор ДНК, 10х буфер и фермент смешивают в пробирке и доводят до конечного объёма бидистиллированной или деионизованной водой. Для ферментативных реакций всегда берут выскоочищенную воду.

Температура и время инкубации. Большинство ферментов работают при 37°С (кроме ферментов из термофильных бактерий). При комнатной температуре скорость работы существенно снижается. Более длительная, чем 1 ч инкубация бывает необходимой, если гидролиз по каким-либо причинам произошел не полностью. При неполной рестрикции на электрофореграмме видны полоски ДНК, соответствующие полоскам нерезаного контроля.

Материалы и оборудование

Раствор ДНК плазмиды pBR322 (1 мг/мл), раствор ДНК фага X (1 мг/мл), рестриктаза EcoRI (10 ед/мкл), термостат, оборудование для фореза.

Растворы

- 10х буфер для рестриктазы ЕсоRI: 500мМ Tris-HCl, pH 7,5; 100мМ MgCl₂; 1000мMNaCl; 10мМДТТ.

- 10х буфер для нанесения образца на гелъ (тема 3).

Методика

1. Перед постановкой реакции (пп. 6-12) с помощью программы рестрикционного картирования RestrictionMapper можно узнать число сайтов рестрикции ЕсоRI в молекуле ДНК фага λ и их размер. Это нужно для того чтобы представлять, что можно будет увидеть на электрофореграмме. Нуклеотидную последовательность фага можно получить в базе данных GenBank так, как описано далее (пп. 2-5).

2. Откройте главную страницу сайта Национального центра биотехнологической информации США (National Center for Biotechnology Information, US National Library of Medicine - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed или http://www.pubmed.com). Введите запрос «Enterobacteria phage lambda, complete genome». Выберите вкладку «Nucleotide» и нажите «Enter». Скопируйте полную нуклеотидную последовательность бактериофага λ, состоящую из 48502 н.п. (GenBank, NC 001416.1).

3. Откройте программу RestrictionMapper (http://www.restrictionmapper.org). Введите в специальное окно нуклеотидную последовательность фага λ.

4. Выберите опцию «Selected individual Enzymes», выберите фермент «EcoRI» и нажмите «Map Sites». Видно, что сайтов рестрикции 5, причем указан номер позиции нуклеотида в точке разрезания. Фрагментов получится 6, поскольку ДНК линейная. Можно узнать размеры всех рестриктов, нажав кнопку «Virtual Digest». Запишите эти размеры.

5. Проделайте ту же работу с плазмидой pBR322, задав запрос «Cloning vector pBR322», или воспользуйтесь прил. 3, 4.

6. Приготовьте реакционную смесь объёмом 20 мкл в 1,7 мл пластиковой пробирке: 10х буфер - 2 мкл, раствор ДНК (1 мг/мл) - 1 мкл, вода - 16,7 мкл.

7. Тщательно перемешайте смесь пипетированием или встряхиванием, осадите капли со стенок пробирки коротким центрифугированием.

8. Достаньте фермент из морозильника, сразу поставьте пробирку в лёд. Наберите микропипеткой нужный объём раствора белка, содержащего 3 единицы активности (0,3 мкл). Добавьте фермент к образцу ДНК и снова быстро уберите рестриктазу в морозильник на -20°С. Перемешайте и соберите жидкость со стенок пробирки коротким центрифугированием.

9. Инкубируйте пробу 1 ч ^а при рекомендуемой температуре 37°С.

10. Остановите реакцию добавлением 1 мкл 200мМ ЭДТА или прогреванием 65 °С в течение 5-10 мин ^б.

11. Добавьте к препарату резаной ДНК 1/10 объёма 10х буфера для нанесения образца на гель, перемешайте пипетированием и внесите ДНК в лунки геля. В этом буфере полученные образцы ДНК можно некоторое время хранить в холодильнике.

12. Проведите электрофорез ДНК при напряжении в 100 В в течение 1,5-2 ч и оцените результаты, просмотрев гель в УФ свете ^в. Сфотографируйте гель.

Примечания

^а Время инкубации допускается увеличивать до 2-х и более часов для полноты гидролиза. Коммерческие препараты ферментов, как правило, не содержат примесей нуклеаз и поэтому не обладают неспецифической нуклеазной активностью. Однако при слишком длительной инкубации для некоторых рестриктаз возможно проявление star-активности или активности со звёздочкой, т.е. снижение специфичности гидролиза ДНК (для ЕсоRI* — NAATTN). Это приведёт к появлению «шмера» вместо чётких полос в геле.

^б Помимо прочего, в прогретых препаратах идёт лучшее разделение рестриктов с близким молекулярным весом, для которых иногда бывает характерно «залипание». Часто такие фрагменты ДНК начинают разделяться на две отдельные полоски только ближе к концу геля. Такое можно увидеть, к примеру, для ЕсoRI-фрагментов ДНК фага А размером 5804 и 5643 нуклеотидов.

^в Число сайтов рестрикции в кольцевой ДНК точно соответствует числу получаемых рестриктов. При полном ЕсoRI-гидролизе плазмиды pBR322 получится один рестрикционный фрагмент. При рестрикции линейной ДНК фага λ (5 сайтов) получится 6 рестрикционных фрагментов с размерами 21226, 7421, 5804, 5643, 4878, 3530 п.н. Если фрагментов в образце (паттерне) видно больше, то это всегда свидетельствует о неполном гидролизе ДНК, т.е. наличии промежуточных продуктов гидролиза («недорестрикция»).