Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

ПЦР
Расчёт праймеров и параметров ПЦР с помощью специальных программ

Имея некоторый опыт в постановке ПЦР в целях экономии времени для подбора праймеров можно использовать коммерческие программные продукты, а также интернет-ресурсы. Аналогично можно произвести другие расчёты, связанные с ПЦР. В частности сайт MOLBIOL.RU - это профессиональная интернет-территория для русскоязычных молекулярных биологов, генетиков, биохимиков, биофизиков, биоинженеров (http://www.molbiol.ru). Выложенная на сайте специальная форма поможет рассчитать параметры ПЦР, программы для подбора праймеров на сайте нет.

Рассчитать (подобрать) праймеры для ПЦР-амплификации конкретной ДНК можно с помощью других интернет-ресурсов. В частности, можно использовать программу Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu) или другие.

В приведённой ниже работе предлагается ознакомиться с интернетпорталами, где можно произвести расчёты для ПЦР (англ. PCR - Polymerase Chain Reaction), т.е. получить практические навыки в работе c программами.

Ход работы

1. Откройте сайт программы Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu). Введите в специальное окно нуклеотидную последовательность гена НАДН- дегидрогеназы гадюки обыкновенной (источник - http://www.pubmed.сом).

2. Нажмите «Pick Primers» и программа подберёт вам несколько пар праймеров. Длина ПЦР-продукта, или ампликона, при этом составит около 200 п.н. Это удобно для выявления какой-либо ДНК, но не подходит для работ, когда нужен полноразмерный ген или конкретный участок гена.

3. Проанализируйте подобранные пары праймеров и выберите на ваш взгляд наиболее подходящую пару, предложенную по умолчанию.

4. Задайте длину амплифицируемого участка ДНК, к примеру, 851-1000 п.н. и подберите праймеры. Узнайте, сколько нуклеотидов потеряет ампликон.

5. Задайте один из праймеров, к примеру, праймер ND2 For из работы 6.2 и рассчитайте второй. Для этого вставьте последовательность праймера в специальное окно и нажмите «Pick Left Primer».

6. Проделайте те же операции с праймером ND2 Rev и после этого со своими праймерами, подобранными «вручную» ранее (работа 6.1).

7. Задайте дополнительные требования к праймерам и проведите расчёт.

8. Откройте главную страницу сайта MOLBIOL.RU (http://www.molbiol.ru). На главной странице найдите раздел «Расчёты», выберите пункт «Расчёт параметров ПЦР».

9. Вводя в специальные окна варьирующие параметры, такие как длина ПЦР-продукта, молярное количество праймеров, Tаg-полимеразы и другие параметры рассчитайте, сколько нуклеотидов израсходуется в реакции и каков возможный максимальный выход ПЦР-продукта. Определите число циклов достаточное для завершения реакции при «идеальном» удвоении.

10. Ознакомьтесь с комментариями к расчётам. Обратите внимание на то, что расчёт ведётся для идеальных условий, когда в качестве матрицы берётся 0,5 мкг геномной ДНК человека. Эти данные носят оценочный характер.