Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Клонирование генов
Рестрикционное картирование вставки ДНК в плазмиде

Лигирование рестрикционных фрагментов ДНК - это во многом случайный процесс. В идеале один фрагмент ДНК вектора и один фрагмент ДНК вставки должны соединиться друг с другом и замкнуться в кольцо. На самом деле среди продуктов лигирования встречаются самые разнообразные сочетания с различным количеством фрагментов в разных ориентациях. Другое дело, что не все они затем селектируются при трансформации. Отбор рекомбинантных клонов в приведённом примере можно вести как по маркеру вектора (Ap^r), так и по маркеру вставки (Km^r), что значительно удобнее.

При отборе по маркеру ампициллин-устойчивости вектора будут селектированы клоны E.coli с исходным «пустым» вектором и с вектором, содержащим вставку, возможно, не одинарную или делетированную. Причём в обеих возможных ориентациях (только одна ориентация бывает при клонировании по сайтам двух разных рестриктаз). Проверить наличие вставки ДНК в вектор и её ориентацию можно рестрикцией. Нужно заметить что в приведённом конкретном случае для выбраковки клонов без вставки можно использовать и так называемую «сине-белую селекцию», основанную на использовании гена ß-галактозидазы LacZ вектора pBluescript II (прил. 6, 15).

При отборе по маркеру канамицин-устойчивости вставки клетки с исходным вектором элимируются, что упрощает анализ трансформантов. Ориентация вставки в приведенном примере тоже не важна, так как ген sacB в конструкте находится под собственным промотором с регуляторной областью sacR и будет экспрессироваться, находясь на любой их двух цепей ДНК (в других случаях важно попасть в рамку чтения!). Кроме того, ген sacB придаёт грамм-отрицательным бактериям чувствительность к сахарозе, т.е. отобранные клоны не должны расти на 2УТ-агаре, содержащем 5% сахарозы.

Материалы и оборудование

Рестриктаза BamHI, рестриктаза EcoRl, плазмидная ДНК из клонов- трансформантов.

Растворы

- Среда 2YT (тема 1).

- 10х буфер длярестриктазы ВаmНI (тема 5).

- Канамицин, раствор 100 мг/мл.

Методика

1. После проведения процедуры трансформации компетентных клеток E.coli лигазной смесью посеять клетки шпателем на свежую агаризованную среду 2YT c антибиотиком канамицином (100 мкг/мл).

2. Отсеять 20 выросших на следующий день колоний на эту же среду.

3. Нарастить отдельные клоны в 5 мл жидкой среды 2YT c антибиотиком.

4. Выделить плазмидную ДНК из отдельных клонов процедурой минипреп.

5. Провести электрофорез плазмидной ДНК, отбраковать аномальные клоны.

6. ДНК из 10 клонов гидролизовать рестриктазой BamHI (вырезать вставку).

7. Провести электрофорез резаной ДНК с маркерами молекулярного веса для контроля размера вставки ДНК (3,8 kb). Клоны с аномальными вставками «чужеродной ДНК» следует выбросить.

8. Определить ориентацию вставки с помощью второй рестриктазы ^а. Для этого гидролизовать ДНК плазмид рестриктазой EcoRI, имеющей сайт узнавания внутри кассеты ближе к гену nptI, чем к sacR. Среди разных плазмид одного размера должно получиться два типа картин рестрикции.

9. Заложить рекомбинантные клоны E.coli с обеими ориентациями вставки ДНК в векторе pBluescript II на хранение.

Примечание

^а Чтобы вставка ДНК в вектор происходила только в одной ориентации нужно использовать для рестрикции два разных фермента.