Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Трансформация бактерий
Трансформация E.coli

Для трансформации E.coli используют компетентные клетки и очищенную плазмидную ДНК или «лигазную смесь». ДНК добавляют к клеткам и выдерживают на льду некоторое время для сорбции ДНК на клеточной поверхности. Затем проводят кратковременный «тепловой шок» при 42°С, при котором ДНК проникает внутрь клеток E.coli из-за резкого повышения текучести мембран и локальных инверсий, добавляют питательный бульон и рассеивают бактерии на агаризованной питательной среде, содержащей антибиотик. В результате экспрессии плазмидных генов антибиотико-устойчивости трансформированные клетки приобретают способность расти на средах с антибиотиками. На плотной питательной среде вырастают за 1-2 суток хорошо видимые колонии (≈ 10⁴-10⁵ клеток), но только из тех клеток, которые получили плазмиду. Т.е. клоны-трансформанты.

Не все трансформанты являются рекомбинантами, т.е. могут быть трансформированы исходным («пустым») вектором, если не применялись специальные процедуры для предотвращения такой возможности. Биологи-молекулярщики, к примеру, используют для рестрикционного гидролиза ДНК два разных фермента или обрабатывают ДНК вектора щелочной фосфатазой, чтобы вектор не мог лигироваться «сам на себя». Можно отличить колонии клонов-рекомбинантов и уже после высева клеток на питательный агар процедурой так называемой «сине-белой селекции» (см. прил. 5, 6, 14).

Приведенная далее процедура трансформации является стандартной. До появления электропораторов широко применялась в практике молекулярно- био(техно)логических исследований и используется до настоящего времени.

Материалы и оборудование

Компетентные «кальциевые клетки» кишечной палочки E.coli XL1- Blue, раствор плазмидной ДНК pBR322 (0,5 мкг/мл), микротермостат.

Растворы

- Среда SOC. На 100 мл: в среду SOB (работа 8.1) внести 5 мл 20% глюкозы.

- 0,5M ß-меркаптоэтанол.

Методика

1. Приготовить раствор плазмидной ДНК pBR322 с концентрацией 5 нг/мл. Для этого из концентрированного 100х стокового раствора (0,5 мкг/мл) взять 1 мкл и добавить к 100 мкл деионизованной воды.

2. Оттаять во льду 0,5M ß-меркаптоэтанол (антиоксидант, восстановитель дисульфидных связей) и аликвоту «кальциевых клеток».

3. К аликвоте 100 мкл компетентных клеток добавить 4 мкл 0,5M ß-меркаптоэтанола и 10-50 пг (2-10 мкл) приготовленного раствора ДНК pBR322.

4. Оставить пробирку при 0°С на 20-30 мин без встряхивания для осаждения ДНК на поверхности клеток.

5. Провести тепловой шок при 42°С в течение 30 с ^а на водяной бане или в микротермостате. После этого сразу поместить пробирку в лёд на 1-2 мин.

6. Добавить 400 мкл среды SOC и встряхивать на шейкере при 37⁰С полчаса.

7. Высеять аликвоту 50 мкл из суспензии клеток на чашку с агаром 2YT, содержащим 100 мкг/мл ампициллина б.

8. Оценить на следующий день эффективность трансформации. Если на чашке Петри выросло N колоний, то эффективность трансформации равна Nx 10⁶ колоний на 1 мкг ДНК ^в.

Примечания

^а Ряд протоколов рекомендуют более продолжительный тепловой шок (до 3 мин).

^б Посев на агаризованные среды производится следующим образом. Простерилизовать в пламени спиртовки стеклянный шпатель. Охладить его. Поместить аликвоту суспензии клеток на поверхность подсушенного питательного агара. Растереть суспензию шпателем по поверхности агара до полного исчезновения остатков жидкости.

^в Если требуется получить как можно больше колоний на 2YT-агаре, например при создании библиотеки, то нужно высеять на чашку Петри 10-50 мкл суспензии для определения титра, а оставшиеся клетки хранить в течение ночи при 0°С. Титр при этом не изменяется. На следующий день рассчитать количество клеток на высев и посеять бактерии шпателем на селективный агар. Максимальная эффективность трансформации может составлять 10-10 клеток-трансформантов на 1 мкг ДНК плазмиды.