Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013
Выделение общей ДНК из клеток
Выделение ДНК из лейкоцитов крови
Изоляция общей ДНК из животной клетки не представляет особой сложности, поскольку плазмалемма, ядерная и митохондриальная мембраны «растворяются» в присутствии анионного детергента додецилсульфата натрия (SDS), а сложной клеточной стенки у животных в сравнении к примеру с растениями нет (см. работу 2.2). Высвободить ДНК из ДНК-белкового комплекса можно с помощью протеиназ или хаотропных солей.
Для этой же цели можно провести как и в случае с бактериями фенольную экстракцию ДНК. Другие вещества при последующем осаждении ДНК спиртом останутся в растворе, и избавиться от них несложно.
ДНК можно выделить из любых тканей, клетки которых содержат ядра, но количественный выход из разных тканей может быть различным. Довольно часто для выделения ДНК используют кровь. Лейкоциты крови, в отличие от зрелых эритроцитов, содержат ядра. Общей ДНК, выделенной из 100 мкл цельной крови достаточно для проведения нескольких рестрикций, ПЦР и секвенирования. Митохондриальная ДНК и РНК также присутствуют в получаемом препарате. В приведённой ниже методике для освобождения ДНК от белков используется фенол. Под словом «фенол» биологи-молекулярщики часто подразумевают смесь водонасышенного фенола с хлороформом 1:1, а не кристаллическое вещество. В смеси с хлороформом фенол работает эффективнее, а изоамиловый спирт гасит пенообразование.
Материалы и оборудование
Образцы крови, микроцентрифуга, морозильник, термостат, микропипетки-дозаторы с наконечниками, микропробирки пластиковые.
Растворы
- Буфер SSC. ЗМ NaCl; 0,ЗМ цитрат натрия, pH 7,0. Для приготовления концентрированного 20х SSC на 1 л нужно взять: NaCl - 175,3 г; цитрат натрия - 88,2 г. pH раствора доводить обычно не требуется.
- 3M ацетат натрия, pH 5,2. На 40 мл: растворить 9,85 г ацетата натрия в 20 мл воды, довести pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой.
- 0,2M ацетат натрия, pH 5,2. Готовится разведением 3М раствора.
- 10% раствор SDS. Растворить 100 мг в 10 мл дистиллированной воды.
- Буфер TE (работа 1.1).
- Смесь фенол-хлороформ (работа 1.1).
- Смесь хлороформ-изоамиловый спирт (работа 1.1).
Методика
1. К 100 мкл цельной крови а добавить 2 объёма дистиллированной воды до конечного объёма 0,3 мл. Тщательно перемешать и оставить на 15 минут.
2. Пробу центрифугировать в течение 10 минут, 5000 об/мин. Супернатант (надосадок, надосадочную жидкость) слить.
3. Осадок клеток отмыть двойным объёмом буфера SSC, добавив в пробирку 200 мкл 1-кратного SSC. Перемешивание аккуратное.
4. Центрифугирование как в п.2. Супернатант слить.
5. К осадку добавить 54 мкл 0,2М ацетата натрия б и 6 мкл 10%-ного раствора SDS. Осадок клеток тщательно ресуспензировать, т.е. перевести в суспензию вновь с помощью микропипетки или вортекса. Инкубировать при 37°С в течение 0,5-1 ч для прохождения лизиса (разрушения) клеток.
6. Добавить 2 объёма буфера ТЕ и провести фенольную депротеинизацию образца. Для этого внести в пробирку равный объём фенол-хлоро формной смеси, хорошо встряхнуть и центрифугировать. Отобрать водную фазу (верхний слой) в чистую пробирку, не захватывая интерфазу.
7. Повторить ту же процедуру, что в п. 6, но со смесью хлороформизоамиловый спирт.
8. К очищенному от белков лизату добавить 1/10 объёма 3М ацетата натрия, рН 5,2, перемешать и высадить ДНК добавив два с половиной объёма холодного 96% этанола и поместив образец на 1-2 часа в морозильную камеру при -20°С. Можно оставить ДНК под спиртом на ночь.
9. Пробу центрифугировать в течение 10 мин при максимальной скорости микроцентрифуги. Супернатант слить. Осадок промыть 70% спиртом.
10. Высушить осадок ДНК на воздухе и растворить в 20 мкл буфера ТЕ в.
Примечания
а Содержание общей ДНК в лейкоцитах составляет 30-60 мкг/мл крови.
б Соль всегда нужно добавлять к образцу до фенольной депротеинизации, т.к. экстракция фенолом в низкосолевом буфере может снизить выход ДНК из-за потерь.
в В состав многих буферных растворов входит трис-гидрохлорид (Tris-HCl), поскольку трис не допускает развитие микрофлоры в подобном буфере в сравнении с другими буферными системами. Стоковый (от англ. stock - запас) концентрированный раствор кислой соли Tris-HCI с нужным значением pH получают титрованием трис-основания (Tris-OH, трис(гидроксиметил)аминометан) соляной кислотой.