Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Электрофорез белков
Окрашивание белков Coomassie R-250

Обработка полиакриламидных гелей после электрофореза включает окрашивание и отмывку от несвязавшегося красителя. Гель заливают трихлоруксусной кислотой, тщательно отмывают водой и помещают в раствор красителя кумасси бриллиантового голубого Cooumassie R-250.

Молекулы красителя связываются с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет синюю окраску, поэтому на геле видны полосы белка с разной интенсивностью окраски, коррелирующей с количеством белка.

После окрашивания белковых полос гель необходимо отмыть от несвязавшегося красителя Cooumassie R-250. Отмывают гели в растворах этанола (или метанола - яд!) и уксусной кислоты.

Материалы и оборудование

Полиакриламидный гель с результатами электрофореза белков. Растворы

- 10% ТХУ (работа 11.1).

- Раствор кумасси R-250 (работа 11.1).

- Отмывающий раствор I (работа 11.1).

- Отмывающий раствор II (работа 11.1).

Методика

1. Сразу после электрофореза поместить гель в емкость для отмывки, залить 10% ТХУ, оставить на 30-60 мин. Можно заменить ТХУ на 5мМ HCl.

2. Добавить воду, хрошо промыть, слить воду.

3. Поместить гель в раствор кумасси для окрашивания ^a на 1-1,5 ч.

4. Слить раствор кумасси и залить отмывающий раствор I ^б на 1-1,5 ч.

5. Удалить отмывающий раствор I.

6. Поместить гель в отмывающий раствор II, и оставить на время пока с геля не исчезнет фон. В процессе проявления геля рекомендуется 2-3 раза менять отмывающий раствор II.

Примечания

^a Чувствительность на порядок выше даёт окрашивание белков ионами серебра. После обработки геля уксусной кислотой и этанолом в растворе I, тщательной промывки этанолом и водой гель переносят на 30 минут в 5 объёмов 0,1% раствора AgNO₃. Затем после промывки водой помещают в такой же объём 0,28М карбоната натрия с добавлением до 0,02% формальдегида. Окрашенные полосы белка появляются через несколько минут. Следует дождаться наилучшего контраста и остановить реакцию промывкой в 10% уксусной кислоте.

^б Как альтернатива: гель заливают холодной водой (200-300 мл), и кипятят ~5'