МИКРОБИОЛОГИЯ БИОЛОГИЯ ПРОКАРИОТОВ ТОМ I - А. В. ПИНЕВИЧ - 2006

ГЛАВА 1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ БАКТЕРИЙ

Every occurrence in Nature is preceded by other occurrences which are its causes, and succeeded by others which are its effects. The human mind is not satisfied with observing and studying any natural occurrence alone, but takes pleasure in connecting every natural fact with what has gone before it, and with what is to come after it.

(Все явления Природы предваряются теми, что служат их причиной, и влекут за собой другие, которые являются их следствием. Человеческому уму мало наблюдать и изучать природное явление; ему отрадно увязать каждый факт с тем, что ему предшествовало, и с тем, что за ним последует).

John Tyndall. The forms of water in clouds & rivers, ice & glaciers (London, 1885).

Познание всегда утилитарно — оно удовлетворяет индивидуальные и коллективные потребности в субстрате, энергии и информации. Традиционные и новые субстраты служат источниками питания, материалами для изготовления одежды, инструментов, приборов, механизмов, строений, транспортных средств и систем коммуникации. В свою очередь, традиционные и альтернативные энергоносители используются в качестве топлива для жилищ, а также приводят в действие технические приспособления. Наконец, информационные, в том числе, эстетические потребности человека объясняют его интерес к элементам окружающей действительности.

Субстратные, энергетические и информационные аспекты в познании макроорганизмов очевидны и прослеживаются с доисторических времен. Напротив, о существовании бактерий не знали до конца XVII в., и до середины XIX в. их самих осознанно не использовали. В качестве исключения можно назвать редко встречающиеся суперпопуляции пигментированных бактерий. В частности, драматический феномен цветения морской воды, вызванный пурпурными бактериями, описал во второй половине I в. н. э. римский энциклопедист Гай Плиний Старший (Caius Plinius Secundus). Ацтеки до испанского нашествия в конце XV в. добавляли в пищу биомассу цианобактерии Spirulina. Третьим примером могут служить миксобактерии, образующие ярко окрашенные плодовые тела (еще в конце XIX в. их принимали за гастромицетов или загифомицетов). В качестве источника энергии биомассу бактерий не применяют, хотя их липиды являются биологической альтернативой нефтепродуктов. До тех пор, пока микробиология не превратилась в фундаментальную науку, что произошло в начале XX в., информационное значение бактерий было незначительным. Наконец, эстетические качества бактерий еще не востребованы, хотя по совершеству форм и яркости окраски некоторые из них не уступают аквариумным рыбкам.

Во второй половине XIX в. было окончательно доказано, что бактерии могут вызывать заболевания человека и животных. Так появилась медицинская микробиология — цитология, физиология и систематика патогенных бактерий, а также ее практические приложения — диагностика, антисептика и терапия. Агрономическая микробиология сформировалась во второй половине XIX в., тогда как биотехнология, основанная на промышленном использовании ферментативной активности микроорганизмов, возникла только в начале XX в.

Микробиология стала самостоятельной наукой благодаря изучению биоразнообразия бактерий и их экологических свойств. Со второй половины XX в. резко выросло число работ, выполненных при помощи методов электронной микроскопии, биохимии и молекулярной биологии. Одновременно с этим активизировались поиски новых объектов — стены лабораторий как бы раздвинулись, предметом исследований стали труднодоступные уголки нашей планеты и другие небесные тела (экзобиология уже не фантастика, а реальность).

Если микробиология поначалу обслуживала медицину, пищевую промышленность и агрономию, то теперь она стала дисциплиной со своими собственными идеями и методами. Ушло в прошлое представление о ней, как о науке второго плана, занимающейся не «биологически близкими» животными и растениями, а невидимыми существами, отрицательная роль которых очевиднее, чем польза.

Благодаря микроорганизмам, прежде всего бактериям, формируется обитаемая оболочка Земли. В ходе эволюции микроорганизмов возникли высшие формы жизни. Микробные сообщества обладают уникальной способностью использовать солнечную энергию и неорганические субстраты, делая их доступными для растений и животных.

Знания о свойствах микроорганизмов приумножились, число изученных представителей мира невидимых глазу существ многократно увеличилось, и человек все шире использует их в своих интересах.

1.1. Открытие бактерий

Хотя с помощью микроскопа человек впервые увидел бактерий только в конце XVII в., о существовании микроорганизмов подозревали еще в античности. Основоположник медицины древнегреческий ученый Гиппократ (Hippokrates) в V в. до н.э. высказал гениальную догадку о том, что ветер разносит невидимых существ, виновников заразных заболеваний. Много позже, в 36 г. до н.э. римский натуралист Марк Теренций Варрон (Marcus Terentius Varro) предположил, что в воздухе содержатся микроскопические животные (лат. animalia quaedam minuta).

Через полторы тысячи лет, в 1546 г., итальянский энциклопедист Джироламо Фракасторо (G. Fracastoro) в трактате «De contagione et contagiosis morbis... » высказал гипотезу о заразном пути передачи сифилиса, чумы, сыпного тифа и оспы, а также описал простейшие способы для предотвращения и лечения этих заболеваний. Спустя еще столетие, в 1658 г. немецкий натуралист Атаназиус Кирхер (A. Kircher) предположил, что причиной чумы служит «живая зараза» (лат. contagium vivum), которая, попав в тело здоровых людей, превращается в «живые частицы» (лат. corpuscula animata). Поскольку с помощью слабого микроскопа увидеть возбудителя чумы, бактерию Yersinia pestis, было невозможно, частицы, о которых говорил Кирхер, были, скорее всего, форменными элементами крови. Но так или иначе, идея

о микроскопических возбудителях заразных болезней была положительно воспринята его современниками.

С начала XVII в. на смену натурфилософии пришел эмпирический метод, обоснованный английским философом и писателем Фрэнсисом Бэконом, бароном Веру- ламским (F. Bacon Baronis de Verulamio). Наука предпочла дедукции чувственное восприятие и индуктивное умозаключение. Началась охота за фактами, и она не обошла стороной бактериологию.

Прогресс бактериологии тесно связан с развитием инструментальной базы, и первое место среди специального оборудования принадлежит оптическим приборам — микроскопам.

Считается, что двухлинзовый микроскоп изобрели не позднее 1590 г. в Голландии братья Иоганнес и Захариас Янсены (J. et Z. Janssen). По другим источникам, это произошло в 20-е годы XVII в., и приоритет принадлежит голландцу Корнелису Дреббелю (С. Drebbel) или итальянцу Галилео Галилею (G. Galilei). Во второй половине XVII в. голландский физик Христиан Гюйгенс (С. Huygens) создал оптическую теорию стеклянных линз. Однако сконструированные им микроскопы давали увеличение в лучшем случае в 100 раз. Вдобавок они обладали низкой разрешающей силой из-за хроматической и сферической аберрации, поскольку свет с разной длиной волны фокусировался в разных плоскостях, а на краю поля зрения изображение было расплывчатым. С помощью таких оптических приборов невозможно было не только изучать строение, физиологические свойства и поведение бактерий, но и просто их увидеть.

Бактерий открыл в 1676 г. натуралист-самоучка, голландец Антониус ван Левенгук (A. van Leeuwenhoek). Парадокс в том, что оптический прибор, который он использовал, был шагом назад, а не вперед в развитии инструментальной базы микробиологии. Это была элементарная лупа, уникальность которой заключалась в том, что она имела крошечное апертурное отверстие и очень короткое фокусное расстояние. В результате по линейному увеличению (х300) при разрешающей силе (1,5 мкм) она в несколько раз превосходила имевшиеся тогда микроскопы, которые состояли из трубки (тубуса), объектива и окуляра. Это позволило Левенгуку не только увидеть бактерий, но и в общих чертах описать их морфологию, причем он был настолько точен и объективен, что мы догадываемся, о каких бактериях идет речь. Левенгука можно по праву считать и основоположником цитологии прокариотов, и их физиологии (в числе прочего, он выяснил, что бактерии обездвиживаются при нагревании или после обработки уксусом).

К сожалению, лупа Левенгука не стала инструментом для серийного производства и широкого использования. До сих пор непонятно, как изготавливалась ее главная деталь, линза — путем обтачивания и шлифовки или путем отливки стеклянного шарика. Кроме того, короткофокусная лупа крайне неудобна для наблюдателя с нормальным зрением (сам Левенгук был близоруким), поскольку ее приходилось подносить вплотную к глазу.

Конструктивные ограничения первых микроскопов удалось преодолеть только в конце XIX в., когда немецкий оптик Аббе (Е. Abbe) разработал теорию получения световых изображений. На ее основе немецкий механик Цейсс (С. Zeiss) и его соотечественник фабрикант стекла Шотт (F. Schott) изобрели составные объективы, иммерсионную масляную систему и конденсорный осветитель. Микроскопы нового поколения обладали максимальной разрешающей силой 0,2 мкм, и в конце 1870-х годов Фердинанд Кон и Роберт Кох ввели их в повседневную практику микробиологических исследований. После того, как Кох предложил методику фиксации мазков на предметных стеклах, заменил природные краски (индиго, гематоксилин и др.) синтетическими анилиновыми красителями (генцианвиолетом, метилротом и др.), а также применил в исследовательских целях микрофотографирование, бактерий стало легко наблюдать, и полученные данные надежно документировать.

Хотя бактерии были обнаружены еще в конце XVII в., общие представления об их строении, физиологии и биоразнообразии начали складываться лишь к середине XIX в., поскольку раньше не было доказательств того, что они могут влиять на жизненные процессы других организмов, а также изменять физико-химические параметры окружающей среды.

В хроники бактериологии вписано много имен, среди которых такие корифеи, как Луи Пастер, Роберт Кох, Фердинанд Кон, С. Н. Виноградский, Мартинус Бейеринк, Альберт Клюйвер (A. J. Kluyver), Роджер Стэниер (R. Y. Stanier), Хэрленд Вуд (H.G. Wood), Ральф Вулф (R. S. Wolfe) и многие, многие другие. Яркий след в истории микробиологии оставили французская школа (в Париже), немецкая школа (в Берлине), голландская школа (в Дельфте) и две американские научные школы (в Беркли и Сан-Диего).

Рис. 1. Надгробие Антониуса ван Левенгука (1632-1723) в Oude Kerk в Дельфте. Фотография автора.

Не отставая от других биологических наук, бактериология постоянно расширяла круг своих объектов, все глубже проникая в закономерности их организации. Первые свидетельства того, что бактерии обладают особыми физиологическими свойствами и проявляют биологическую активность, были получены при изучении брожения и гниения.

1.2. Брожение и гниение

Практическое использование этилового спирта и молочной кислоты уходит корнями в незапамятную древность. Однако до начала XIX в. образование этих веществ не связывали с жизнедеятельностью микроорганизмов — дрожжей и бактерий.

Химическую природу спиртового брожения, или «ферментации» (лат. fermentum — бурление) доказал в 1810 г. французский физик Гей-Люссак (J. L. Gay-Lussac). В рамках господствовавшего представления, что сахар расщепляется на «меловую» кислоту и винный спирт, он приблизился к современному пониманию брожения как окислительно-восстановительной реакции. В конце 1830-х годов Каньяр де Латур (С. Cagniard de Latour), Шванн (Т. Schwann) и Кютцинг (F. Т. Kützing) сообща установили, что спиртовое брожение представляет собой биологический процесс, вызванный «сахарными» грибами, или дрожжами рода Saccharomyces. Однако этот правильный вывод вызвал резкую критику со стороны химиков-органиков, сторонников «контактной» теории брожения — Берцелиуса (J. J. Berzelius), Велера (F. Wöhler), Либиха (J. von Liebig) и Мичерлиха (Е.Mitscherlich). Они рассматривали дрожжей как белковый «фермент», который катализирует превращение сахара в этанол, однако сам, подобно неорганическому катализатору, остается неизменным.

Луи Пастер был химик по образованию, и его научная карьера началась с открытия стереоизомерии. Однако он не интересовался химической стороной брожения, и рассматривал его только под физиологическим углом зрения. В 1850-х годах он основательно занялся изучением микроорганизмов, вызывающих накопление молочной и масляной кислот, а также этилового спирта. Его первым вкладом в микробиологию было доказательство биологической природы молочнокислого брожения. Он установил, что возбудители — это микроорганизмы, которые обходятся без воздуха и по морфологии отличаются от дрожжей (теперь их относят к бактериям, в частности к роду Lactobacillus).

В 1861 г. Пастер исследовал микробных возбудителей маслянокислого брожения (Clostridium butyricum). Полученные результаты позволили ему прийти к парадоксальному для того времени выводу, что жизнь возможна в отсутствии кислорода. Открытие анаэробиоза оказало огромное влияние на дальнейшее развитие микробиологии.

В 1858 г. Траубе (М. Traube) пришел к идее о том, что сахар сбраживается биологическим катализатором, или «энзимом» (франц. en zymotique — происходящий из бродила), который выделяют дрожжи. Однако прошло много лет, прежде чем в 1897 г. Бухнер (Е. Buchner, Нобелевская премия по химии, 1907 г.) получил бесклеточный препарат дрожжей, где сохранялась активность «зимазы» — ферментного комплекса, расщепляющего сахарозу до этилового спирта и диоксида углерода. В 1905 г. Харден (A. Harden, Нобелевская премия по химии, 1929 г.) установил, что для спиртового брожения требуется неорганический фосфат. Вскоре после этого Эйлер-Хельпин (Н. von Euler-Chelpin, Нобелевская премия по химии, 1929 г.) определил молекулярную природу продуктов расщепления глюкозы и идентифицировал соответствующий коэнзим — НАД. С этого момента началась история энзимологии и связанной с ней прикладной науки, биотехнологии.

Другой микробный процесс, анализ которого стал важной вехой в понимании биоразнообразия бактерий — это гниение. Оно связано с разложением богатого белком органического материала и наблюдается при заболеваниях животных, некротических поражениях органов и тканей, а также при разложении трупов. Механизм гниения связан, в частности, с образованием зловонных и токсичных продуктов декарбоксилирования лизина и орнитина — путресцина (лат. putor — зловоние и facio — делать) и кадаверина (лат. cadaver — мертвое тело). Когда во второй половине XIX в. были разработаны методы выделения бактерий и приемы получения чистых культур на питательных средах, идея Юстуса Либиха о том, что гниение связано со спонтанным распадом органических веществ, была отвергнута. Гниение всесторонне изучили в 1870-е годы Луи Пастер и Фердинанд Кон. В частности, они установили, что в его основе лежит разложение азотсодержащих веществ под воздействием бактерий. Кон провел параллель между растительной «диастазой», превращающей крахмал в сахар, и «энзимами», с помощью которых бактерии расщепляют белки на простые азотсодержащие соединения, чтобы использовать их для своего роста. Луи Пастер впервые сообщил об аммонификации мочевины и выделил шаровидные бактерии, отвечающие за этот процесс (теперь их относят к виду Sporosarcina ureae).

1.3. Инфекции

Начиная с 1870-х годов гниение и токсикогенные гнойно-септические процессы стали рассматривать как причину, а не следствие заболеваний человека и животных, инфицированных болезнетворными бактериями.

Основатель французской микробиологической школы Луи Пастер доказал связь между жизнедеятельностью конкретных групп бактерий и разными типами брожений. В свою очередь, Роберт Кох, создавший немецкую школу медицинской бактериологии, выяснил, что бактериальные инфекции вызывают характерные гистопатологические изменения, и зараженная ткань содержит болезнетворного агента. Развивая идеи анатома Генле (J.Henle), который в 1840 г. разработал стратегию поисков возбудителей инфекционных болезней, Кох сформулировал минимальные требования, так называемую «триаду Коха», необходимые для того, чтобы установить причинно-следственную связь между специфическим микробным агентом и патологическим процессом, который он вызывает:

— с помощью микроскопических методов установить, что инфекционный агент обнаруживается только (и всегда) при данной болезни;

— отделить инфекционного агента от сопутствующих микробов и вырастить его чистую культуру;

— воспроизвести болезнь у экспериментального животного, заразив его чистой культурой инфекционного агента; контролем может служить повторное выделение этого агента из зараженного животного.

В 1876 г. Кох определил этиологическую природу возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis). Это была первая инфекционная бактерия, обнаруженная в крови больного животного, и одновременно с этим — первая патогенная бактерия, полученная в культуре. Таким образом, было доказано, что конкретный вид бактерий вызывает заболевание со специфической симптоматикой.

1870-1890-е годы стали «золотым веком» охоты за микробами. В 1874 г. Хансен (Е. Hansen) обнаружил возбудителя проказы Mycobacterium leprae, после чего открытия болезнетворных бактерий последовали одно за другим.

В 1881 г. Луи Пастер и Штернберг (G. Sternberg) открыли возбудителя бактериальной пневмонии Streptococcus pneumoniae и тогда же Огстон (A. Ogston) описал патогенного стафилококка Staphylococcus aureus, вызывающего фурункулез и такие заболевания, как эндокардит и менингит.

В 1882 г. Роберт Кох выделил бактерию легочного туберкулеза Mycobacterium tuberculosis. Во время эпидемии, разразившейся в 1883 г. в Египте и Индии, он открыл возбудителя холеры — холерного вибриона Vibrio cholerae. В том же году Клебс (Е. Klebs) и Лефлер (F.Loeffler) сообщили о находке этиологического агента дифтерии Corynebacterium diphtheriae.

В 1884 г. ученик Коха, Гаффки (G. Gaffky) идентифицировал возбудителя брюшного тифа, Salmonella typhi. Одновременно с этим Розенбах (F. J. Rosenbach) описал спорообразующую бактерию Clostridium tetani, вызывающую грозное нейротропное заболевание — столбняк. В 1885 г. Эшерих (T. Escherich) открыл кишечную палочку Escherichia coli.

В 1889 г. Нейсер (A.Neisser) обнаружил первого агента венерического заболевания — возбудителя гонореи Neisseria gonorrhoeae. В 1892 г. Вэлч (W. Welch) и Наттэл (G. Nuttal) выявили возбудителя газовой гангрены, которым оказалась спорообразующая анаэробная бактерия Clostridium perfringens.

Чума часто упоминается в анналах истории; в частности, о ней упомянул в V в. до н. э. древнегреческий писатель Фукидид (Thucydidis) в своей «Historiae». Возбудителя, чумную палочку Yersinia pestis независимо друг от друга нашли Йерсен (A. Yersin) и Китасато (S. Kitasato) во время эпидемии в Гонконге в 1894 г.

В 1895 г. Ван Эрменгем (Е. van Ermengem) обнаружил Clostridium botulinum, возбудителя смертельно опасного пищевого отравления — ботулизма.

В 1898 г. Шига (К. Shiga) выделил агента бактериальной дизентерии Shigella dysenteriae. Возбудителя сифилиса Treponema pallidum открыли в 1905 г. Шаудин (F. Schaudinn) и Гофман(Е. Hoffmann). В 1906 г. Борде (J. Bordet) и Жангу (О. Gengou) установили этиологического агента коклюша—Bordetella pertussis.

Изучение свойств возбудителей бактериальных инфекций стало залогом первых побед над ними. В 1867 г. английский медик Джозеф Листер (J. Lister) изобрел химическую антисептику (лат. anti-sepis — противоядие) и предложил использовать фенольные соединения для стерилизации открытых ран и операционных полей. В 1880-1890-е годы Роберт Кох и Фердинанд Кон, а также Пауль Эрлих (Р. Ehrlich, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1908 г.) открыли антибактериальное действие других химических веществ, в частности, формалина. Температурную стерилизацию изобрел во второй половине 1870-х годов известный английский натуралист Джон Тиндэл (J. Tyndall).

Одновременно с представителями немецкой школы, которые занимались поисками возбудителей болезней, французские бактериологи искали биологические средства борьбы с инфекционными заболеваниями. Луи Пастер и его ученики предложили аттенуацию (лат. at-tenuo — ослаблять), или способ снижения вирулентности патогенного микроба в результате многократных пересевов на искусственных средах при субоптимальной температуре (42°С) или после заражения этим микробом животного, которое не является основным носителем. Введение аттенуированного возбудителя позволило вызвать активный иммунитет к ряду заболеваний, в частности к сибирской язве и чуме.

В начале 1900-х годов наблюдения за процессом внутриклеточного пищеварения у беспозвоночных привели И. И. Мечникова (Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1908 г.) к открытию фагоцитоза и созданию теории клеточного иммунитета. Одновременно с этим Беринг (Е. von Behring, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1917 г.) и Китасато разработали теорию гуморального иммунитета. Исключительно важное значение для иммунологии имела гипотеза Пауля Эрлиха о распознавании антигенов специфическими антителами.

Первый антибиотик, пенициллин открыл в 1928 г. Флеминг (А. Fleming, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1945 г.). Его промышленное производство началось в 1943 г. За относительно короткий период, в 1955-1962 гг. были описаны до 90% антибиотиков, продуцентами которых являются актинобактерии рода Streptomyces. В настоящее время общее число антибиотиков, в том числе полусинтетических, гибридных и мутасинтетических, достигло нескольких десятков тысяч. Успехи иммунизации и антибиотикотерапии в 1940-1960-е годы настолько впечатляли, что в 1969 г. генеральный хирург США Стюарт (W. H. Stewart) объявил Конгрессу о полной и окончательной победе над инфекционными заболеваниями. Но, к сожалению, оптимизм оказался преждевременным. Хотя, по данным ВОЗ, в 1980-1990-е годы смертность от инфекционных заболеваний снизилась почти в 20 раз (с 797 случаев на 100 тыс. населения до 36 случаев на 100 тыс. населения), в конце XX в. она по-прежнему составляла 25%. Самой частой причиной летального исхода служила пневмония (3,5 млн случаев в год), острые кишечные заболевания (2,2 млн случаев в год) и туберкулез (1,5 млн случаев в год). В настоящее время обнаружены новые этиологические агенты острых и хронических инфекций, например, Legionella pneumoniae и Helicobacter pylori. «Реванш» болезнетворных бактерий обусловлен техническим прогрессом, антропогенным изменением окружающей среды, демографическими сдвигами и расширением международных контактов. Другими причинами, которые негативно влияют на борьбу с болезнетворными бактериями, служат адаптационная изменчивость, приводящая к появлению резистентных форм, а также неэффективность превентивных мер здравоохранения.

1.4. Экология бактерии

Бактерии занимают всевозможные ниши — от благоприятных для массового развития до экстремальных, где скорость распада АТФ, НАД(Ф)Н, белков и нуклеиновых кислот превышает скорость биосинтеза de novo или скорость репарации. Бактерии по эко лого-географическому распределению являются космополитами, чему способствуют их микроскопические размеры, разнообразие и лабильность метаболических систем, а также способность переносить стрессы, вызванные неблагоприятными условиями окружающей среды (англ, environmental stress).

Основоположником экологической бактериологии был С. Н. Виноградский, который превзошел Луи Пастера и Роберта Коха в понимании физиологической специализации микроорганизмов. Он создал учение о роли отдельных групп бактерий в природных экосистемах и об участии бактериальных сообществ в циклах биогенных элементов. Изучая нитрифицирующих бактерий, он сформулировал в 1890-х годах концепцию об элективных (лат. electio — выбор) условиях развития. Согласно ей, специализированные бактерии получают физиологическое преимущество перед своими партнерами по экоценозу и начинают численно преобладать над ними. На методе элективных сред основывается скрининг биоразнообразия бактерий, а также лабораторный анализ бактериальных сообществ и отдельных видов.

В 1892 г. Такстер (R. Thaxter) выделил миксобактерий, которые являются одними из главных компонентов почвенной микробиоты, и описал их дифференцированные клетки и плодовые тела. Распространение и экологическую роль других типичных обитателей почвы, актиномицетов установили в 1920-е годы Зелман Ваксман (S. A. Waksman, Нобелевская премия по физиологии и медицине,1952 г.) и Мартинус Бейеринк.

В 1900-1940-е годы Бейеринк и его ученики усовершенствовали метод Виноградского и впервые получили накопительные и чистые культуры бактерий, принадлежащих к разным эколого-физиологическим группам. К ним относились бактерии, гидролизующие мочевину; разрушающие агар или целлюлозу; окисляющие водород, серу или метан; восстанавливающие сульфат или нитрат; синтезирующие целлюлозу; светящиеся; анаэробные спорообразующие; аэробные диазотрофные; молочнокислые; уксуснокислые.

В начале XX в. от общей экологии бактерий отделились самостоятельные дисциплины — почвенная микробиология, водная микробиология и геомикробиология. Первые микроскопические наблюдения бактериальных пейзажей в почвенных образцах, отобранных в разных регионах Земного шара, провел в начале 1920-х годов С. Н. Виноградский на биостанции Бри-Конт-Робер (Brie-Comte-Robert) под Парижем. Полученные результаты позволили ему создать концепцию об автохтонных и аллохтонных видах как двух основных группах бактерий в почвенных экосистемах. «Автохтонными» называют бактерий, характерных для почвы конкретного типа (греч. avtos — сам и chthon — земля; «живущий на своей земле»). Они имеют невысокую, относительно стабильную численность и используют труднометаболи- зируемые почвенные субстраты, прежде всего гумус. Это понятие можно использовать и по отношению к нормальной микрофлоре покровов животных и нормальным эпифитам растений. В свою очередь, «аллохтонными» названы бактерии, случайно заселяющие почву конкретного типа (греч. allos — чужой и chthon — земля; «живущий на чужой земле»). Их также называют «зимогенными» (греч. zyme — закваска и genea — рождение; «образующий ферменты»), поскольку они накапливаются при эпизодическом попадании в почву легкометаболизируемых субстратов.

Важную роль в изучении биоразнообразия почвенных бактерий сыграл метод «стекол обрастания», предложенный H. Н. Холодным в 1930 г., и капиллярный метод, разработанный в 1961 г. Б. В. Перфильевым и Д. Р. Габе. Выдающиеся представители российской школы почвенной микробиологии Д. Г. Звягинцев, Н. А. Красильников, Е. Н. Мишустин и Г. А. Надсон, а также их зарубежные коллеги, в первую очередь Зелман Ваксман и Лочхед (A. G. Lochhead) внесли основной вклад в изучение экологии почвенных микроорганизмов.

Первые исследования бактериального состава континентальных водоемов были проведены в конце XIX в. на богатых каротиноидами пурпурных бактериях, которых описал еще в конце 1830-х годов немецкий протистолог Эренберг (С. Ehrenberg). Адаптированных к слабому освещению и с трудом поддающихся культивированию зеленых аноксигенных бактерий Г. А. Надсон открыл только в 1906 г.

Пионером морской микробиологии является Зобелл (С. Zobell), который в 1940- 1950-х годах определил видовой состав популяций бактерий, заселяющих толщу морской воды. Во второй половине 1970-х годов Джэнеш (H. W. Jannash) провел исследования микробиоты Мирового океана, в результате чего было установлено, что численность психрофильных (греч. psychros — холодный и phileo — любить) бактерий увеличивается с глубиной. Вообще изучение психрофилов началось еще в конце XIX в., после того, как Фостер (J. Foster) показал, что биолюминесцентные бактерии могут расти при 0°С. В 1950-1970-х годах биологию психрофилов изучали Морита (R. Y. Morita), Бэрос (J. A. Baross) и Ингрэм (J. L. Ingraham). Позднее интерес к этим объектам поубавился, и особое внимание стали уделять экстремально термофильным бактериям и гипертермофильным археям.

В настоящее время бактерии, живущие в прибрежных и материковых областях полярных регионов, опять стали предметом активного изучения. Известный специалист по гипертермофилам Деминг (J. W. Deming) в последние годы занялась бактериями, живущими в зоне фазового перехода воды и льда. Громкий резонанс получили результаты анализа бактериальных сообществ в подледном антарктическом оз. Восток.

При исследовании морских экосистем в 1979 г. Хаянос (A. A. Yayanos) обнаружил адаптированных к высокому гидростатическому давлению барофильных (греч.

baros — тяжелый и phileo — любить) бактерий. По данным Джэнеша, полученным в середине 1970-х годов, в пробах воды, извлеченных с океанических глубин, содержатся олиготрофные (греч. oligos — немногочисленный и trophe — пища) бактерии, которые для своего роста довольствуются низкими концентрациями питательных субстратов.

В 1988 г. Чизхолм (S. W. Chisholm) открыла в Атлантическом океане цианобактерию Prochlorococcus marinus, которая оказалась чемпионом среди бактерий по общей численности и биологической продуктивности. Культивируемые штаммы Р. marinus наряду с главным объектом генетики цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803 (геном которой полностью секвенирован в 1997 г.) становятся основными моделями для изучения молекулярных механизмов фотосинтеза.

Обширный раздел геомикробиологии посвящен бактериям-экстремофилам, к числу которых относятся, в частности, термофильные (греч. thermos — теплый и phileo — любить) формы. Первую термофильную бациллу выделил Мигуэль (Р. Miguel) в 1888 г. В дальнейшем были описаны разные представители грамположительных и грамотрицательных бактерий, имеющие метаболизм аэробного или анаэробного типа. При температуре >60°С могут развиваться только прокариоты, и именно такие условия создаются в слежавшемся сене, компостных кучах и других органических материалах, а также в природных гидротермах и некоторых гидротехнических сооружениях.

Исследование термофильных бактерий в антропогенных гидротермах проводил Зейкус (J. G. Zeikus). В природных местообитаниях — термальных источниках и геотермальных полях Северной Америки и Гренландии — их изучали Брок (Т. D. Brock), Кастенхольц (R. W. Castenholz) и Штеттер (К. О. Stetter). Термофилами из разных регионов и экосистем Евразии плодотворно занимаются Г. А. Заварзин, Г. И. Каравайко и другие отечественные ученые.

В 1980 г. Кавасуми (Т. Kawasumi) получил в культуре аэробную водородокис- ляющую бактерию Hydrogenobacter thermophilus, а следом за ним в 1992 г. Хубер (G. Huber) выделил аэробную термофильную водородную бактерию Aquifex pyrophüus.

Галофильные (греч. alos — соль и phileo — любить) бактерии, немногочисленные виды которых живут в засоленных водоемах, привлекли внимание после классических работ, которые провели Клод Зобелл в 1940-е годы и Ларсен (Н. Larsen) в 1960-е годы. Типичными обитателями хорошо прогреваемых соленых водоемов является экстремально галофильная пурпурная бактерия Ectothiorhodospira halochloris, которую Трюпер (H.G.Trüper) описал в 1977 г., и экстремально галофильные цианобактерии родов Synechocystis и Spirulina. В 1980-1998 гг. в соленых водоемах тропических, полярных и умеренных широт были обнаружены новые галофильные бактерии из родов Antarctobacter, Haloanaerobium, Haloincola, Halomonas, Halothermothrix и др. Все они отлично приспособлены к высокой солености, причем механизмы устойчивости к солевому стрессу у них отличаются от тех, которые используют экстремально галофильные археи.

Большинство бактерий предпочитают нейтральные или слабо щелочные условия, но встречаются мезофильные и термофильные ацидофилы (лат. acidus — кислый и греч. phileo —любить). В первую очередь это специализированные литотрофы, которые используют энергию окисления таких субстратов, как железо и сера. Многие из них имеют практическое значение, и их подробно изучили Браэрли (J. A. Brierley), Г. И. Каравайко и Р. С. Головачева в конце 1970-х годов.

Логика изучения бактерий-экстремофилов ставит ряд новых задач. В частности, по инициативе Г. А. Заварзина предпринят комплексный анализ гидротермальных экосистем, галофильных сообществ в морских лагунах, а также алкалифильных (лат. alcalinus — щелочной и греч. phileo — любить) бактерий в содовых озерах, служащих современными аналогами доисторических биотопов.

После того, как в 1888 г. Мартинус Бейеринк впервые приступил к исследованию симбиоза бактерий с бобовыми растениями, перечень экологических ниш, занимаемых симбиотическими бактериями (греч. symbiosis — сожительство), расширился и стал включать в себя филлосферу и ризосферу растений, наружные покровы и пищеварительную систему животных, а также — в случае эндоцитобиоза — цитоплазматический и ядерный компартменты эукариотных клеток.

В конце XX в. экологическая микробиология стала изучать «нетрадиционные» ниши и их обитателей — эндолитических (греч. endon — внутри и Utos — камень) бактерий, живущих внутри камней и скал; бактерий, поселяющихся в толще земной коры, в том числе, обитателей нефтеносных пластов; бактерий из обрастаний, биопленок и других экстремофильных экосистем.

Самое молодое направление экологической микробиологии занимается изучением взаимосвязанных проблем гиперанабиоза и экзобиологии.

Анализ редко встречающихся ситуаций, когда бактерии в состоянии полного физиологического покоя, или анабиоза (греч. anabiosis — воскрешение из мертвых) сохраняют жизнеспособность на протяжении геологических периодов, позволяет не только определить хронологические границы существования индивидуального организма, но и изучить структуру таких «живых ископаемых». Способность к анабиозу служит предпосылкой расселения жизни в Мировом пространстве в соответствии с гипотезой панспермии (греч. pan-sperma - единое семя). Принято считать, что ее выдвинул в 1900-е годы Сванте Аррениус (S. A. Arrhenius, Нобелевская премия по химии, 1903 г.), хотя на самом деле ее высказал еще в 1821 г. де Монливо (S.-G. de Montlivault), а Рихтер (Н. Е. Richter) пытался в 1865 г. дополнить аналогичными соображениями селекционистскую теорию Чарлза Дарвина (С. Darwin). Из крупных микробиологов гипотезу панспермии поддержал в 1870-е годы Фердинанд Кон. В рядах ее стронников были и представители других естественных наук, в частности, известный физик Кельвин (W. Thomson Lord Kelvin).

Косвенным доводом в пользу существования на небесных телах органической жизни служат данные о способности бактериальных эндоспор к анабиозу и исключительной устойчивости этих дифференцированных клеток к очень жестким воздействиям со стороны окружающей среды.

Исследования в области экзобиологии получили новый импульс после того, как на Марсе, а также на юпитерианской луне Европе была обнаружена вода — необходимое условие для физиологических процессов. Очередным доводом в пользу существования внеземной биологической активности послужило сообщение Маккея (D.S. McKay) о находке в 2000 г. внутри марсианского метеорита ALH84001 частиц магнетита, очень похожих на бактериальные магнитосомы — цитоплазматическими включения биогенных минералов железа.

Экология бактерий расстается с редукционизмом Луи Пастера и Роберта Коха, который доминировал на заре микробиологии, но теперь тормозит ее поступательное развитие. Современные исследователи одинаково успешно используют принцип элективности С. Н. Виноградского и его методы прямого анализа микробных сообществ. Лабораторное моделирование на чистых культурах постепенно уходит в прошлое. Будущее принадлежит системному анализу микробиоты in situ на основе полевых наблюдений и физиологических тестов, а также при помощи молекулярно-биологического инструментария (полимеразной цепной реакции, зондов и т. д.). Перспективы микробной экологии велики, как и проблемы, подстерегающие тех, кто трудится на этом поприще.

1.5. Цитология бактерий

С начала промышленного производства лабораторных микроскопов во второй половине XIX в. анализ морфологии бактерий стал сравнительно несложным делом. Были охарактеризованы основные формы и клеточные агрегаты бактерий, придаточные структуры и цитоплазматические включения, а также структурные превращения бактерий, в частности при образовании дифференцированных клеток. Выдающимся достижением стало открытие в 1876-1877 гг. Фердинандом Коном, Робертом Кохом и Джоном Тиндэлом покоящихся резистентных клеток бактерий — эндоспор. Однако внутреннее строение бактерий долго оставалось загадкой, и в первую очередь это касалось бактериального «ядра».

Первые сведения по функциональной цитологии бактерий стали накапливаться в 1950-1960-е годы, когда в микробиологию пришли методы электронной микроскопии. Широкая возможность изучать анатомию бактерий с помощью электронного микроскопа появилась после того, как:

а) Вильямс (R. С. Williams) включил в арсенал бактериологических методик процедуру напыления клеток и субклеточных структур тяжелыми металлами;

б) Паладе (G. A. Palade, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1974 г.) стал использовать для фиксации оксид осмия;

в) Ньюмен (S. В. Newman) разработал способ приготовления ультратонких срезов из заливок материала в метакрилатные смолы;

г) Келенбергер (Е. Kellenberger) предложил метод фиксации забуференным глу- таровым альдегидом и метод контрастирования с помощью ацетата уранила.

В 1960-1970-е годы Солтон (М. R. J. Saltón) и Мюррэй (R. G. Е. Murray) получили первые данные о строении оболочки и внутренних мембран, Чэпмен (G. В. Chapman) и Робиноу (С. Robinow) описали морфологию нуклеоида и деление, Фиц-Джеймс (Р. С. Fitz-James) провел исследования дифференциации эндоспор, Депамфилис (М. L. DePamphilis) охарактеризовал ультраструктуру жгутика, а Шмидт (Т. М. Schmidt) — серных глобул и других функциональных включений.

Во второй половине 1970-х годов, когда Наннинга (N. Nanninga) ввел в электронную микроскопию процедуру вакуумного протравливания поверхности замороженного образца (англ. freeze-etching) и, в особенности, когда появился метод сверхскоростной криофиксации и криозамещения воды органическими растворителями, цитология бактерий научилась избавляться от артефактов. Изучение динамической ультраструктуры бактерий вышло на новый качественный уровень в начале 1990-х годов после внедрения иммунозондов, а также методов регистрации автофлуоресценции и эпифлуоресценции in situ. Это весьма стимулировало изучение динамической анизотропии бактериальной клетки, репликации ДНК, сегрегации дочерних хромосом и механизма бинарного деления.

1.6. Генетика бактерии

Бактерии размножаются исключительно вегетативным способом. Из-за отсутствия гетерозиготности и мейотического кроссинговера их генетический анализ долго ограничивался регистрацией спонтанных и индуцированных мутаций, а также фенотипических проявлений гомологической рекомбинации в результате парасексуального процесса — векторного переноса генов от донора к реципиенту.

В 1943 г. Лурия (S. Luria, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1969 г.) и Дельбрюк (М. Delbrück, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1969 г.) заложили основы генетики бактерий — они показали, что бактерии подчиняются дарвинистским принципам естественного отбора, основанного на накоплении случайных мутаций. Благодаря интенсивному исследованию генетики бактерий и бактериофагов уже в следующем десятилетии были получены данные о природе материальных носителей генетической информации.

В 1928 г. Гриффит (F. Griffith) открыл «трансформирующее начало», которым бактерии обмениваются друг с другом, что приводит к изменениям их генотипа. В 1944 г. Эвери (О. Т. Avery), Маклеод С. М. Macleod) и Маккарти (М. McCarty) доказали, что генетическая трансформация бескапсульных авирулентных пневмококков осуществляется с помощью ДНК, полученной из клеток вирулентного инкапсулированного штамма. Следом за этим Херши (A. Hershey, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1969 г.) и Чейз (М. Chase) установили, что при заражении фагом Т2 внутрь бактериальной клетки проникает только вирусная ДНК. Тем самым была окончательно доказана роль ДНК как носителя наследственной информации.

В начале 1950-х годов у бактерий были обнаружены внехромосомные автономно реплицирующиеся генетические элементы. По предложению Ледерберга (J. Lederberg, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1958 г.) их назвали плазмидами. Они сообщают бактериям такие селективно-важные признаки, как фертильность, колициногенность, множественная лекарственная устойчивость, способность разрушать ксенобиотики и т. д. «Горизонтальный» перенос генов плазмидами обеспечивает генетическую гетерогенность бактериальных популяций.

В 1946 г. Ледерберг и Тейтем (Е. L. Tatum, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1958 г.) открыли конъюгацию, или контактный процесс, обеспечивающий передачу генов при помощи плазмид от донора к реципиенту. Это главный тип «горизонтального» переноса генов у бактерий. На протяжении 1940-1950-х годов анализ рекомбинантных признаков у эксконъюгантов был успешно использован для картирования генома Е. coli.

В 1949 г. Андрэ Львов (A. Lwoff, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1965 г.) открыл у Bacillus megaterium лизогению — феномен индуцированного фагом клеточного лизиса. Гомологическая рекомбинация в результате трансдукции, или переноса бактериальных генов с хромосомой умеренного фага осуществляется с помощью тех же механизмов, что и конъюгативная рекомбинация. В 1952 г. Ледерберг и Зиндер (N. G. Zinder) обнаружили этот процесс у сальмонелл.

В начале 1980-х годов Рид (R. R. Reed) выявил у бактерий негомологичную рекомбинацию. Она обеспечивается транспозонами, которые при помощи мигрирующих инсерционных последовательностей случайным образом интегрируются в геном бактерии-акцептора. В 1968 г. Линн (S. Linn) и Эрбер (W. Arber, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1978 г.) открыли ферменты-рестриктазы, мишенью которых служит проникшая в клетку чужеродная ДНК. В 1970 г. Смит (Н. Smith, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1978 г.) обнаружил у Haemophilus influenzae первую сайтспецифическую рестриктазу Hind II. Это открытие легло в основу современных технологий рекомбинантных ДНК и методов клонирования генов. В конечном счете, это привело к созданию того раздела цитогенетики, который изучает инфраструктуру, консерватизм и изменчивость бактериальных геномов.

Одним из первых на способность бактерий минерализовать самые разнообразные органические вещества указал голландский микробиолог де Йонг (L. Е. den Dooren de Jong). В 1926 г. он предложил классифицировать представителей рода Pseudomonas в соответствии со спектром субстратов, используемых для роста.

Тем не менее, открытие адаптационного синтеза ферментов не противоречило представлениям о консервативной основе метаболизма. Альберт Клюйвер так сформулировал в 1926 г. принцип биохимического единства жизни: «Все организмы, от маслянокислой бактерии до слона, имеют одинаковую биохимическую основу». В измененной редакции (где вместо Clostridium butyricum фигурирует Е. coli) этот афоризм необоснованно приписывают Жаку Моно (J. Monod, Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1965 г.). По существу, Клюйвер высказал идею, что биохимия имеет общий фундамент. Это универсальный генетический код, стандартные мономеры биополимеров, глобальные системы преобразования энергии и магистральные пути конструктивного метаболизма.

Наряду с этой парадигмой Клюйвер предложил концепцию о путях метаболизма, согласно которой анаболические и катаболические процессы состоят из цепей взаимно сбалансированных окислительно-восстановительных реакций. Альберта Клюйвера можно также считать «отцом» сравнительной биохимии, поскольку он рассматривал микробов как модели, на которых можно реконструировать метаболические системы других биологических объектов, в том числе высших животных и растений.

Решающее значение для понимания механизмов биосинтеза аминокислот и нуклеотидов, а также для изучения метаболизма витаминов и участия их коферментных форм в ферментативных реакциях, имели работы Снелла (Е. S. Snell), выполненные в 1950-1960-е годы на бактериях кишечной группы, псевдомонадах и низших актиномицетах.

Во второй половине 1950-х годов Роджер Стэниер провел классическое исследование каротиноидов у пурпурных бактерий. На основе полученных данных был реконструирован генеральный путь биосинтеза полиизопреноидов, а также выяснена защитная роль каротиноидов при окислительном стрессе.

На фундаментальных знаниях о метаболизме бактерий основана биотехнология. С помощью бактерий, причем во многих случаях это генетически сконструированные штаммы-сверхпродуценты, можно получать продукты питания, микробную биомассу, биополимеры, ферменты, первичные метаболиты (аминокислоты, нуклеотиды), вторичные метаболиты (антибиотики и др.), витамины, поверхностно-активные вещества, спирты, кетоны, органические кислоты и т. д. С начала 1980-х годов, после разработки технологии рекомбинантных ДНК и создания генной инженерии, появилась возможность клонировать в клетках Е. coli «чужие» гены, помещенные под контроль сильных или индуцируемых промоторов. Это обеспечивает экспрессию в клетках Е. coli ценнейших фармакологических продуктов — белков других бактерий (стрептокиназы, пенициллиназы и др.) или белков ядерных организмов (инсулина, интерферона и др.).

Метаболический потенциал тионовых бактерий используется в промышленном процессе микробного выщелачивания металлов. Симбиотические ассоциации с участием псевдомонад, родококков и других аэробно дышащих бактерий очищают воду, загрязненную промышленными, сельскохозяйственными, городскими и бытовыми отходами. Они также осуществляют ремедиацию (лат. remediatio —излечение), т. е. устраняют в окружающей среде вредные последствия антропогенной деятельности.

Аэробы. Высокая окислительная способность аэробных бактерий обеспечивает максимальное извлечение энергии из питательных субстратов. Это также является причиной неутилитарного окисления, или «кометаболизма» алифатических и ароматических соединений с помощью дегидрогеназ и оксигеназ. В 1960-е годы Роджер Стэниер и Гунсалус (R.P.Gunsalus) выполнили цикл пионерских работ на представителях рода Pseudomonas. Полученные ими результаты позволили выяснить механизмы разрушения нефтепродуктов, пестицидов и других ксенобиотиков (греч. xenos — чужой и bios —жизнь; «вещества неприродного происхождения, не включающиеся в биологический круговорот»), а также изучить роль, которую играют в этом процессе плазмиды «биодеградации».

Промышленная очистка с помощью бактериальных агрегатов, или активного ила была впервые налажена в 1913 г. в Манчестере. В усовершенствованном виде этой технологией продолжают пользоваться и по сей день. Параллельно разрабатываются и внедряются новые методы, основанные на эксплуатации каскадных очистных сооружений, в которых вода освобождается от органических загрязнений и биогенных элементов, способных вызвать эвтрофикацию, то есть цветение природных водоемов.

Анаэробы. Концепция анаэробиоза, или «жизни без кислорода» стала важным теоретическим выводом из исследований, выполненных Луи Пастером в 1857- 1877 гг. Он впервые разделил микроорганизмов, в зависимости от отношения к кислороду, на аэробов (франц. äerobies; «существа, живущие на воздухе» и анаэробов (франц. änaerobies; «существа, живущие без воздуха»). Кроме этого, он обратил внимание на существование переходных вариантов отношения к кислороду, которые теперь называют факультативным анаэробиозом, микроаэробиозом и микроаэрофилией. Используя разные методы для удаления кислорода из воздуха и производя дегазацию питательных сред, он выделил в 1877 г. первую культуру анаэробной патогенной бактерии (Clostridium septicum).

В середине 1930-х годов Хангейт (R. Е. Hungate) предложил метод «вращающихся пробирок», который до сих пор применяется для получения чистых культур анаэробов. Он выделил ряд новых форм, в том числе целлюлолитических бактерий Bacteroides succinogenes и Micromonospora propionici, которые живут в рубце жвачных животных. В результате работ Хангейта выяснилось, что анаэробы встречаются в пищеварительном тракте животных, илах, затопленных почвах и т. д., причем во всех этих нишах они составляют >90% общей численности микробиоты.

Большой вклад в изучение анаэробов внес Баркер (Н. A. Barker), который получил культуры, сбраживающие разнообразные субстраты. В 1940-1950-е годы он с помощью радиоизотопного метода установил, что пропионовокислые бактерии осуществляют гетеротрофную фиксацию СО₂ и что ацетил-СоА является не только продуктом окисления пирувата, но может быть и метаболическим предшественником при биосинтезе ацетоацетата и цитрата.

Процесс анаэробной очистки, при котором вместе с метаногенными археями ключевую роль играют целлюлолитические, амилолитические и протеолитические бактерии, а также кислотообразующие клостридии и гетеротрофные ацетогенные бактерии родов Syntrophomonas и Syntrophobacter, был изучен в 1970-е годы в лабораториях Зейкуса и Зиндера (S. Н. Zinder).

Бактериальный фотосинтез. В конце XIX в. Фердинанд Кон, Варминг (Е. Warming), Эсмарх (Е. Esmarch), Перти (M.Perty), Цопф (W. Zopf) и С. Н. Виноградский впервые описали пурпурных бактерий и одноклеточных зеленых бактерий. Однако они не считали их фототрофами, поскольку в ту пору фотосинтез не отделяли от образования кислорода. Зависимость пурпурных бактерий от света впервые продемонстрировал в 1883-1888 гг. Энгельман (W.Engelmann), открывший на их примере фотокинез и фототаксис, т. е. изменение под воздействием света скорости движения и ориентации клеток. Доказательство того, что пурпурные бактерии способны к фотосинтезу без выделения кислорода, было получено только в 1907-1919 гг. в работах Молиша (Н. Molisch) и Будера (J. Buder). На рубеже 1960- 1970-х годов Пфенниг (N. Pfennig) разработал классические методы выделения и культивирования аноксигенных фототрофных бактерий.

В ходе исследования конструктивного метаболизма одноклеточных зеленых бактерий Эрнон (D. I. Аrnon) открыл в 1966 г. новый ферредоксинзависимый путь ассимиляции СО₂, который позже назвали «путем Ивенса — Бьюкенена — Эрнона». В 1974 г. Ричард Кастенхольц впервые описал нитчатых зеленых бактерий. Особенности их конструктивного метаболизма еще долго не удавалось выяснить, и только в 1992 г. Фукс (G. Fuchs) доказал, что у них функционирует ранее не известный «гидроксипропионатный» цикл автотрофной ассимиляции СО₂.

В 1983 г. Гест (Н. Gest) открыл гелиобактерий — аноксигенных бактерий, содержащих бактериохлорофилл д. В 1979 г. Шиба (Т. Shiba) сообщил о новой физиологической группе квази-фототрофных, или аэробных аноксигенных фототрофных бактерий, способных к росту и фотосинтезу только в присутствии кислорода.

Цианобактерий до начала 1960-х годов рассматривали как «синезеленых водорослей» и, естественно, не пытались изучать их бактериологическими методами.

То, что цианобактерии с самого начала получили статус ботанических объектов, объясняется элементарно просто—до того, как Роджер Стэниер приравнял прокариотов к бактериям, любой выделяющий кислород фототрофный организм помещали в царство Plantae. Дополнительную роль сыграло то обстоятельство, что цианобактерии, как правило, не гидролизуют полимерные субстраты, не выделяют специфических экзометаболитов и не проявляют патогенности, т. е. лишены тех свойств, которые на заре бактериологии считали характерными для бактерий. Кроме того, цианобактерий не удается выделить в чистую культуру путем высевов на элективные среды.

То, что синезеленые водоросли не относятся к растениям, непосредственно вытекало из «принципа Стэниера», что прокариоты тождественны бактериям. С начала 1980-х годов стали употреблять предложенный им термин «цианобактерии». После того, как в 1960-е годы Аллен (М. М. Allen) получила чистые культуры цианобактерий, впервые появилась возможность изучать их с помощью физиолого-биохимических и генетических методов. В настоящее время эта группа бактерий охарактеризована едва ли не лучше остальных.

В 1959 г. Ховард Гест сделал принципиально важное открытие: на примере пурпурной аноксигенной бактерии Rhodospirillum rubrum он показал, что фотосинтетический аппарат связан с хроматофорами, или внутриклеточными мембранами. В 1950-1990-е годы пурпурные бактерии и цианобактерии стали модельными объектами при изучении фотосинтеза.

С помощью спектроскопических методов Дайсенс (L. N. М. Duysens) в 1952 г. установил, что у пурпурных бактерий имеется «реакционный центр»—структурная единица фотосинтетического аппарата, в которой происходит светозависимая окислительно- восстановительная реакция. В 1968 г. Рид (D. W. Reed) и Клэйтон (R. К. Clayton) выделили с помощью мягких детергентов препарат реакционного центра Rhodopseudomonas sphaeroides, а Феер (G. Feher) в 1970 г. определил его состав. В 1972 г. он же идентифицировал методом ЭПР-спектроскопии хинон -первичный акцептор реакционного центра. В 1975 г. Норрис (J. R. Norris) выяснил, что

первичным донором в реакционном центре Rh. sphaeroides является «димер» бак- териохлорофилла а.

В начале 1980-х годов Хартмут Михель (Н. Michel, Нобелевская премия по химии, 1989 г.) вырастил кристаллы реакционного центра пурпурной бактерии Rhodopseudomonas viridis.Благодаря этому удалось построить трехмерную модель его гомолога — реакционного центра второй фотосистемы (ФС2). На основе данных, полученных в 1996 г. на цианобактерии Synechococcus sp. группой Фромме (P. Fromme) благодаря использованию рентген-кристаллографии с уровнем разрешения 4,5Â, была построена модель реакционного центра первой фотосистемы (ФС1). В конце XX в. было реконструировано филогенетическое древо цианобактерий и произошедших от них «простых» пластид.

Хемосинтез. В 1877 г. Шлезинг (T. Schloesing) и Мюнц (A. Müntz) обнаружили, что почвенные бактерии окисляют аммиак до нитрата. Затем Уорингтон (R. Warrington) показал, что нитрификация идет в два этапа, и промежуточным продуктом является нитрит. Однако только в 1886-1888 гг. С. Н. Виноградский установил, что бактерии могут получать энергию путем окисления неорганического субстрата (такой способ энергетического питания был назван литотрофией). В качестве объектов он использовал серную бактерию Beggiatoa alba и железобактерию Leptothrix ochraceae. Продолжив изучение литотрофии на нитрифицирующих бактериях родов Nitrosomonas и Nitrobacter, он открыл в 1890 г. хемосинтез — сочетание литотрофии с углеродной автотрофией.

В 1893 г. В. Т. Шевяков описал «гигантскую» бактерию Achromatium oxaliferum, окисляющую сульфид до элементной серы. В свою очередь, Лаутерборн (R. Lauterborn) описал в 1907 г. «гигантскую» нитчатую серную бактерию, относящуюся к роду Thioploca. Честь открытия тионовых бактерий (род Thiobacillus), окисляющих серу до сульфата, принадлежит Мартинусу Бейеринку, который сообщил о них в 1904 г.

В 1931 г. Стикленд (L. H. Stickland) установил, что восстанавливающие сульфат анаэробные бактерии могут использовать для этого молекулярный водород. Позднее выяснилось, что энергию, освобождающуюся при окислении водорода, способны усваивать и аэробные бактерии. В 1976 г. Г. А. Заварзин открыл аэробных карбок- сидобактерий, которые используют угарный газ в качестве источника энергии и одновременно с этим в качестве строительного материала. Позднее, в 1983 г. Джон Зейкус обнаружил карбоксидобактерий-анаэробов.

В середине 1980-х годов Хэрленд Вуд проследил путь автотрофного биосинтеза ацетата у окисляющей водород бактерии Clostridium thermoaceticum, который позднее был назван «путем Вуда».

Большой неожиданностью для микробиологов стало открытие двух новых типов литотрофии. В 1995 г. ван де Грааф (A. A. van de Graaf) обнаружил бактериальный процесс анаэробного окисления аммиака нитритом и одновременно с этим Виддель (F. Widdel) установил, что анаэробные бактерии могут с помощью нитрата окислять двухвалентное железо.

Метилотрофия. В 1906 г. Зенген (N. L. Sôngen) впервые изучил бактерий, которые используют метан, метанол или другие одноуглеродные соединения в качестве источника энергии и углерода. Однако до 1970-х годов отсутствовали сведения об их распространении в природе и роли, которую они играют в цикле углерода; не знали, каковы их физиологические свойства и биоразнообразие.

Во второй половине 1970-х годов, в первую очередь благодаря исследованиям Квайла (J. R. Quayle), были расшифрованы два механизма ассимиляции формальдегида у метилотрофов—«рибулозомонофосфатный путь», или «путь Квайла» и «сериновый путь».

До недавнего времени микробное окисление метана бактериями рассматривали как облигатно-аэробный процесс. Однако в 2002 г. Михаэлис (W. Michaelis) сообщил, что микробиота микробных матов со дна Черного моря, в состав которой входят метаногенные археи и сульфатредуцирующие бактерии, может in vitro в отсутствии кислорода окислять метан.

Диазотрофия. В 1885 г. Хельригель (Н. Hellriegel) и Вильфарт (H. Wilfarth) обнаружили, что бобовые растения усваивают атмосферный азот (теперь такой способ питания называется диазотрофией). Через несколько лет Мартинус Бейеринк выяснил, что способностью к диазотрофии обладают не сами растения, а их эндосимбионты — клубеньковые бактерии рода Rhizobium.

Первую свободноживущую анаэробную диазотрофную бактерию, Clostridium pasteurianum выделил С. Н. Виноградский в 1902 г. В том же году Бейеринк и Ван Дельден (A. van Delden) описали первую свободноживущую аэробную бактерию, Azotobacter chroococcum.

В 1942 г. Фогг (G. Е. Fogg) обнаружил диазотрофию у цианобактерий, а в 1950 г. Ховард Гест — у пурпурных бактерий.

1.8. Палеомикробиология

Поскольку бактерии имеют микроскопический размер и простую морфологию, считалось, что их окаменелости невозможно отличить от похожих абиотических структур, или псевдофоссилий. Поэтому тема палеомикробиологии не обсуждалась и практические задачи, связанные с разработкой методов для изучения древних микроорганизмов, не ставились. Сомнения в том, что существуют достоверные ископаемые остатки бактерий, развеялись в середине 1970-х годов в результате исследований, проведенных микробиологами совместно с геологами и геохимиками.

Ископаемые строматолиты и микрофоссилии. Материалом, на котором можно изучать ранние этапы эволюции органической жизни на Земле, служат ископаемые строматолиты и микрофоссилии.

Ископаемые строматолиты (греч. stroma — ложе и lithos — камень), или слоистые окаменелости формировались в прошедшие геологические периоды в результате прижизненной минерализации микробных матов — стратифицированных сообществ, основным компонентом которых являются цианобактерии. Строматолиты образуются и в современный геологический период (см. раздел 7.3.5); морфологически они сходны со строматолитами, которые были широко распространены в морских и наземных докембрийских биотах. Самые ранние ископаемые остатки такого типа имеют возраст до 3 млрд лет.

В то время как строматолиты демонстрируют макроструктуру древнего микробного консорциума, тончайшие распилы микрофоссилий (лат. fossicius — ископаемый), или отдельных окаменевших микроорганизмов при световом микроскопировании дают представление о форме ископаемых бактерий и даже об их ультраструктуре.

В начале 1980-х годов Шопф (J. W. Schopf), Нол (А. Н. Knoll) и другие палеомикробиологи провели анализ микрофоссилий на шлифах докембрийских осадочных пород возрастом 1,5-3,5 млрд лет. Как выяснилось, эти микроископаемые почти не отличаются от современных цианобактерий. В настоящее время для них получены морфометрические данные, характеризующие форму и размер клетки, структуру трихома, строение чехла, организацию микроколонии и т. д. При сопоставлении ископаемых одноклеточных и нитчатых цианобактерий (соответственно 1,4-10³ образцов для 260 геологических формаций и 650 образцов для 160 геологических формаций) с 600 образцами современных цианобактерий выяснилось, что микрофоссилии можно идентифицировать с точностью до рода. Поэтому им присваиваются названия современных цианобактерий с добавлением приставки ра1аео- или ео-, а также окончания -opsis или -ites (например, Palaeolyngbya и Aphanocapsaopsis). Большинство докембрийских микрофоссилий (263 морфотипа), имеющих внешние признаки цианобактерий, соответствует диагнозам современных хроококковых (25%) и осциллаториевых (37%) штаммов.

Таким образом, цианобактерии были широко распространены 2 млрд лет назад, что подтверждается геологическими и геохимическими данными, а также результатами радиоуглеродного анализа. Более ранние микрофоссилии из сланцев формации Апекс на западе Австралии, имеющие возраст 3,5 млрд лет, также обнаруживают сходство с осциллаториевыми цианобактериями. А поскольку возраст Земли равен 4,5 млрд лет, это означает, что цианобактерии являются одними из первых обитателей нашей планеты.

Молекулярные ископаемые. Наряду со строматолитами и микрофоссилиями палеомикробиологическими документами служат некоторые типы биомолекул. Они в переносном или прямом смысле слова являются «молекулярными ископаемыми» (англ. molecular fossil).

Молекулярными ископаемыми в переносном смысле слова являются геномные нуклеиновые кислоты — ДНК у клеточных организмов и ДНК или РНК у неклеточных живых существ (вирусов). Благодаря непрекращающемуся матричному копированию в сочетании с репарацией они сохраняют наиболее консервативные участки своей структуры на протяжении сотен миллионов и даже миллиардов лет. Поэтому определяя и сравнивая последовательности нуклеотидов в составе ДНК или РНК, мы можем нарисовать эволюционное древо (см. раздел 2.5).

Молекулярными ископаемыми в прямом смысле слова являются биомолекулы, сохраняющиеся после смерти клетки почти без изменений на протяжении геологических периодов. Это происходит потому, что они, в отличие от нуклеиновых кислот, белков и углеводов, имеют жесткий каркас, нечувствительный к ферментативному или абиотическому воздействию.

Особое место среди таких биомолекул занимают некоторые типы липидов, представляющих собой насыщенные углеводороды с разветвленным и/или циклическим скелетом. Они называются рекальцитрантными биомолекулами (лат. re-calcitro — брыкающийся; «не поддающийся разрушению»).

Для каждого из трех филогенетических доменов можно назвать специфические рекальцитрантные липиды. Для Archaea это фитаны, для Еuсаrуа — стероиды, для Bacteria —гопаноиды (см. раздел 8.3.3.1). В частности, в осадочных породах, возраст которых насчитывает 2,5 млрд лет, содержатся гомологи гопаноидов, входящих в состав современных цианобактерий.

Реанимированные древние бактерии. Некоторые прокариоты сохраняют жизнеспособность на протяжении геологических периодов при условии полного анабиоза. После реанимации их можно изучать с помощью традиционных цитофизиологических методов.

В 1998 г. появилось сообщение о выделении живой культуры Staphylococcus succinus — бактерии, вегетативные клетки которой в течение 25-35 млн лет хранились в куске янтаря из Доминиканской республики (Южная Америка). Однако даже такое долголетие выглядит очень скромно по сравнению с фантастическим анабиозом продолжительностью в 250 млн лет. Именно этот возраст имеют вегетативные клетки Bacillus sp., которые были замурованы в кристаллах поваренной соли, найденных в 2000 г. в штате Нью-Мехико (США).

В отличие от вегетативных клеток, эндоспоры не только полностью приостанавливают свою жизнедеятельность при переходе в анабиотическое состояние (англ, dormancy — сонливость), но и приобретают высочайшую устойчивость к стрессовым воздействиям (англ, resistance — сопротивление). Благодаря этим свойствам они могут прорастать через очень большое время после своего образования. В желудке мумифицированной пчелы, найденной в куске янтаре, они сохранялись в интактном виде 25-40 млн лет.

1.9. «Виртуальная» микробиология

В конце XX в. изменились не только методы, но и концептуальные подходы, с помощью которых изучаются природное разнообразие бактерий и их распределение по нишам.

Классическая стратегия изучения биоразнообразия — «охота за микробами», выращивание культур и комплексный фенотипический анализ накопленного материала постепенно отходит на задний план. В качестве альтернативы исследуется полиморфизм определенных участков генома, прежде всего генов рРНК. Попросту говоря, ищут удостоверения личности, а не их владельцев.

С этой целью из воды, почвы или другого субстрата выделяют ДНК, принадлежащую фенотипически не охарактеризованным объектам. Для начала достаточно всего 10^-8 г ДНК. Затем в полимеразной цепной реакции с помощью специфических праймеров амплифицируют гены 16S рРНК. Полученные амплификоны при необходимости дополнительно клонируют в бактериальных плазмидах, после чего проводят автоматическое секвенирование. В заключение сравнивают реконструированную нуклеотидную последовательность с банком генетических данных.

С помощью данного метода можно обнаружить «фантомные» бактерии, которые не выявляются при микроскопировании природных образцов и ничем не проявляют себя в лабораторных условиях.

Преимущество данного подхода состоит в том, что не нужно тратить время и технические средства для накопления, очистки и выращивания бактериальных культур, а также для комплексного анализа их фенотипических свойств.

Но далеко не всех бактерий, которых мы наблюдаем с помощью микроскопа в природных образцах, можно заставить размножаться в лаборатории. Речь идет о так называемых «некультивируемых» бактериях (англ. viable but nonculturable, VBNC). Такое латентное состояние возникает из-за стресса при попадании в искусственную нишу.

Есть еще одна проблема, связанная с культивированием — это использование чистых культур, постоянных физико-химических условий и относительно богатых питательных сред. За возможность быстро и без помех изучать свойства отдельных объектов современный исследователь платит тем, что анализирует монстрозные фенотипы, адаптированные к искусственному гомеостазу. Условия в «тепличной» нише резко отличаются от природных условий. В отсутствии межвидовой конкуренции и при заданном режиме питания усиливается дрейф генов, что приводит к накоплению геномных различий между музейными штаммами и природными популяциями.

Будущее экспериментальной микробиологии — за смешанными культурами и моделированием природной среды, где существует трофическая сеть, а также устанавливаются градиенты питательных субстратов и продуктов микробного метаболизма.