ИММУНОЛОГИЯ - Ройт А. - Мир 2000

Глава 29. Иммунологические методы

ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И НАПРАВЛЕННАЯ ДОСТАВКА ГЕНОВ

Трансгенные животные

Один из путей для изучения функций той или иной молекулы — это создание трансгенных животных, у которых ген данной молекулы либо делетирован, либо экспрессируется, но на сверхвысоком уровне или с образованием измененного продукта. Оригинальный способ получения трансгенных животных состоит в инъекции примерно ста копий данного гена непосредственно в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетку переносят затем в яйиевод ложнобеременной мыши-самки, в матке которой и развивается эмбрион. Потомство таких мышей отличается вариабельностью. У небольшого числа эмбрионов одна или больше копий гена встраивается в одну из хромосом до первого клеточного деления. Эти животные являются гетерозиготами по трансгену. У другой (также малочисленной) части животных включение трансгена происходит после первого деления, и мыши оказываются химерами, у которых наряду с нормальными клетками имеются клетки, содержащие трансген. У большинства мышей трансген не встраивается в хромосому. Статус каждой мыши определяют путем исследования образцов клеток на присутствие гена, для чего применяют саузерн-блоттинг. На основании данных анализа отбирают трансгенных гетерозиготных животных, которых затем используют для скрещивания и получения гомозиготной трансгенной линии.

Обычно включение трансгенов в хромосому происходит случайным образом и в виде блока из нескольких копий. Важно, что при включении трансгенного блока не образуется разрывов в других, функционально важных генах. Характер экспрессии трансгенов зависит от ряда факторов. Иногда эти гены оказываются под контролем промоторов общего типа и экспрессируются в большинстве тканей. В других случаях они связаны с тканеспеиифическими промоторами и их экспрессия ограничена лишь некоторыми тканями и клетками (например, лимфоцитами) или определенными стадиями развития. К интерпретации фенотипа трансгенных животных необходимо подходить с осторожностью, поскольку высокую экспрессию трансгенов в несоответствующих тканях нельзя считать физиологичной.

Направленная доставка гена

Этот более тонкий метод на первом этапе состоит в переносе гена, который взаимодействует или рекомбинирует с исследуемым эндогенным геном и вызывает в результате его изменение. Например, в этом эндогенном гене может произойти делеция (что имеет место у так называемых «нокаутных» мышей), в нем могут возникнуть точковые мутации или выпасть экзон. Такой измененный ген вводят в эмбриональную полипотентную стволовую клетку, где он рекомбинирует с аналогичным эндогенным геном. Эту стволовую клетку переносят затем в бластоцисту или имплантируют описанным выше способом (рис. 29.27).

Рис. 29.27. Трансгенных животных можно получать путем направленного изменения гена, происходящего в результате гомологичной рекомбинации. Для этого используют сегмент экзогенного гена (трансген), который содержит 1) последовательность, гомологичную последовательности клеточного гена, но несущую мутацию, и 2) маркерный ген. Путем электропорации трансген вводят в эмбриональные стволовые клетки, а затем, ориентируясь на присутствие маркерного гена, отбирают клетки, в которые включился экзогенный ген Далее производят отбор клеток с рекомбинацией экзогенного и эндогенного генов. Эти клетки вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку ложнобеременных мышей. Потомство таких мышей состоит из нормальных трансгенных животных.

Вопросы для размышления

■ С использованием специально полученных новых моноклональных антител и иммунофлуоресцентного метода вы идентифицировали некую молекулу на поверхности Т-лимфоцитов. Выберите методы, позволяющие получить ответы на следующие вопросы:

■ Если культивировать Т-клетки в присутствии митогена конканавалина А и полученных вами антител, взятых в различных концентрациях, будут ли эти антитела снижать способность клеток пролиферировать? Уменьшится ли число Т-клеток, продуцирующих ИЛ-2?

■ Чему равна молекулярная масса идентифицированной молекулы?

■ Присутствует ли эта молекула на Т-клетках CD4⁺ и CD8⁺?

■ Чему равна концентрация получаемых антител в культуральной среде антителопродуцирующей гибридомы?

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА

Coligan J.E., Kruisbeck А.М., Margulies D.H. et al. (eds.) 1991. Current Protocols in Immunology. New York: Greene Publishing Associates & Wileyinterscience, continually updated.

Hudson L., Hay F.C. 1989. Practical Immunology. 3rd. Oxford: Blackwell Scientific Publications.

Johnstone A., Thorpe R. 1987. Immunochemistry in Practice. 2nd edn. Oxford: Blackwell Scientific Publications.

Rose N.R. et al. (eds.) 1992. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 4th edn. Washington: American Society of Microbiology.

Weir D.M. 1986. Handbook of Experimental Immunology. Vols I & II. 4th edn. Oxford: Blackwell Scientific Publications.

Winter F., Griffith A.D., Hawkins R.E. et al. 1994. Making antibodies by phage display technology. Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55.