БІОХІМІЯ - Лабораторний практикум - НАУ 2015

МОДУЛЬ V

ГОРМОНАЛЬНА РЕГУЛЯЦІЯ МЕТАБОЛІЗМУ

Лабораторна робота 13

ВИЯВЛЕННЯ ГОРМОНІВ У МОДЕЛЬНИХ РОЗЧИНАХ

Мета роботи: підтвердити наявність в модельних розчинах гормонів різної хімічної будови.

Основні теоретичні відомості

Гормони — біологічно активні речовини, що виробляються самими організмами, у надзвичайно низьких концентраціях регулюють метаболічні процеси та фізіологічні функції організму. Гормони поділяють на істинні, або справжні, які виділяються в кров і впливають на органи-мішені на відстані (дистантно), та тканинні, або гістогормони, що виділяються в тих же тканинах, на функціонування яких і впливають. Істинні гормони за хімічною будовою поділяють на білково-пептидні, похідні амінокислот, стероїдні. Більшість тканинних гормонів — похідні арахідонової (ейкозантетраєнової) кислоти, а також похідні амінокислот.

Тиреоїдні гормони — похідні амінокислот фенілаланіну та тирозину — трийодтиронін (Т3) і тетрайодтиронін або тироксин (Т4) — синтезуються щитоподібною залозою. До їх складу входять відповідно три або чотири атоми йоду. Ці гормони впливають на енергетичний обмін (є роз’єднувачами дихання та фосфорилування), активують біосинтез білків, морфогенез (стимулюють формування й розвиток органів).

Гормони мозкового шару наднирників — адреналін (епінефрин) та норадреналін (норепінефрин) — також є похідними фенілаланіну та тирозину. Адреналін прискорює частоту та силу серцевих скорочень, підвищує артеріальний тиск, впливає на тонус м'язів шлунково-кишкового тракту, ока тощо. Нарадреналін діє як нейромедіатор.

Інсулін — гормон білкової природи, що виробляється підшлунковою залозою, складається з 51 амінокислотного залишку, містить 2 поліпептидні ланцюги — ланцюг А з 21 та ланцюг В з 30 амінокислотних залишків. Ланцюги з’єднані між собою двома дисульфідними зв’язками, ще один дисульфідний зв'язок міститься у межах ланцюга А. Основна біологічна роль інсуліну — зниження рівня глюкози в крові.

Стероїдні гормони є похідними стерану (циклопентанпергідрофенантрену); попередником для їх синтезу в організмі є холестерол (холестерин):

 стеран     холестерол

До стероїдних гормонів належать кортикостероїди (гормони кори наднирників — мінералокортикоїди та глюкокортикоїди), статеві гормони (естрогени, андрогени) та кальцитріол (похідне вітаміну D3, сполука гормонального типу дії, бере участь у регуляції обміну кальцію). Стероїдні гормони розрізняються замісниками біля 10-го, 13-го, 17-го атомів карбону. Кортикостероїди містять метильні радикали біля 10-го та 13-го атомів, етильний радикал — біля 17-го атома (усього 21 атом карбону, їх називають С21-стероїди). Андрогени не мають етильного радикала біля 17-го атома (С19-стероїди). Естрогени мають лише один метильний радикал — біля 13-го атому (С18-стероїди). Стероїдні гормони мають у своєму складі гідроксильні та кетогрупи біля різних атомів карбону. Наприклад, андростерон, естрон (фолікулін) мають кетогрупу в 17-му положенні та гідроксильну — у 3-му. Стероїдні гормони виводяться з організму у вигляді 17-кетостероїдів з сечею, 1 — 25 мг на добу, кількість залежить від віку та статі, максимальна екскреція спостерігається у 25-річному віці. У разі стресів кількість 17-кетостероїдів у крові та сечі збільшується.

Обладнання: штатив із пробірками, піпетки, скляні палички, крапельниці, водяна баня, флуориметр.

13.1. Якісні реакції на тиреоїдні гормони

Матеріали та реактиви: тиреоїдин, концентрована HNO3,
10 %-й розчин йодату калію КІО3, хлороформ, 10 %-й розчин гідрокарбонату калію КНСО3, 1 %-й розчин крохмалю, 10 %-й розчин сірчаної кислоти.

Порядок виконання роботи

Під час кислотного гідролізу тиреоїдних гормонів утворюється йодидна кислота, унаслідок взаємодії якої з йодатом калію виділяється вільний йод:

Йод у хлороформі має фіолетове забарвлення. У пробірку поміщають кілька кристалів тиреоїдину, додають 10 крапель концентрованої нітратної кислоти і нагрівають 3—5 хв на водяній бані. Потім доливають 20 крапель 10 %-го розчину йодату калію. Уміст перемішують та охолоджують.

У пробірку додають 15 крапель хлороформу, струшують і спостерігають за розвитком забарвлення.

У процесі лужного гідролізу тиреоїдних гормонів (кип'ятіння з КНСО3) утворюється КІ. Реакція між йодидом та йодатом є окисно-відновною: йодид калію КІ є відновником, а калію йодат КІО3 — окисником. Виділений йод визначають за допомогою крохмалю (синє забарвлення) у кислому середовищі:

У ступку поміщають 10 таблеток тиреоїдину та ретельно їх розтирають. Розтерту масу пересипають у колбу для гідролізу, додають 20 мл 10 %-го розчину натрію гідрокарбонату. Колбу зі зворотним холодильником поміщають на азбестову сітку і вміст колби кип’ятять 15 хв (з моменту закипання) за помірного нагрівання.

У пробірку відміряють 25 крапель охолодженого гідролізату, додають 3 краплі 1 %-го розчину крохмалю, потім 4 краплі 10 %-го розчину калію йодату і приблизно 10—15 крапель 10 %-го розчину сірчаної кислоти до знебарвлення і далі до появи синього забарвлення, що з'являється в результаті реакції вільного йоду, який виділився, з крохмалем.

13.2. Якісні реакції на інсулін

Матеріали та реактиви: розчин інсуліну (препарат інсуліну в ампулах), 0,1 М розчин нінгідрину, концентрована азотна кислота, аміак, реактив Фоля, реактив Міллона, концентрований розчин гідроксиду натрію, 10 %-й розчин гідроксиду натрію (чи калію),
1 %-й розчин сульфату міді, 20 %-й розчин сульфосаліцилової кислоти (ССК).

Порядок виконання роботи

У п’ять пробірок вносять по 5 крапель інсуліну для ін’єкцій та проводять з ними реакції Фоля, Мілона, нінгідринову, ксатопротеїнову, біуретову (див. лабораторні роботи 1, 2).

Високочутливою є реакція осадження білків ССК. У пробірку з розчином інсуліну (10—20 крапель) додають по 1 краплі розчину ССК, спостерігають випадіння білого осаду.

13.3. Якісні реакції на адреналін

Матеріали та реактиви: розчин адреналіну 0,1 %-й (препарат адреналіну в ампулах), 1 %-й розчин хлориду заліза (ІІІ), 25 %-й розчин аміаку, 1 %-й розчин сульфанілової кислоти, 5 %-й розчин нітриту натрію, 10 %-й розчин карбонату натрію, 0,2 %-й розчин гексаціаноферату (III) калію, кристалічна аскорбінова кислота,
10 %-й розчин гідроксиду натрію, 10 %-й розчин йодату калію КІО3, 10 %-й розчин оцтової або ортофосфорної кислоти, 5 %-й розчин соляної кислоти, концентрована соляна кислота, нітритно-молібденовий реактив (5 г нітриту натрію та 5 г молібдату натрію розчиняють в 50 мл дистильованої води).

Порядок виконання роботи

Реакція на адреналін із хлоридом заліза (III)

Адреналін досить легко вступає в окисно-відновні реакції. Гормон та продукти його окислення можна виявити кольоровими реакціями. Із розчином хлориду заліза (III) адреналін та норадреналін утворюють комплексну сполуку смарагдово-зеленого кольору. Із додаванням краплі розчину аміаку забарвлення стає вишнево-червоним, а потім жовтогарячо-червоним.

У пробірку вносять 10 крапель 0,1 %-го розчину адреналіну та 1 краплю 1 %-го розчину хлориду заліза (ІІІ). Потім додають 1 краплю аміаку. Спостерігають появу та зміну забарвлення.

Реакція на адреналін з діазобензенсульфокислотою

Метод ґрунтується на здатності адреналіну утворювати з діазобензенсульфокислотою сполуку червоного кольору.

Для одержання діазобензенсульфокислоти в пробірку відміряють по 3 краплі 1 %-го розчину сульфанілової кислоти та 5 %-го розчину нітриту натрію, перемішують струшуванням. Потім у пробірку додають 5 крапель 0,1 %-го розчину адреналіну та 3 краплі 10 %-го розчину карбонату натрію. Уміст перемішують струшуванням і спостерігають за розвитком забарвлення.

Реакція на адреналін з йодатом калію

Адреналін у кислому середовищі з йодатом калію утворює сполуку червоно-фіолетового кольору.

У пробірку вносять 1 краплю 0,1 %-го розчину адреналіну, 5 мл води. Відбирають в іншу пробірку 0,5 мл розведеного розчину адреналіну, додають 1 мл розчину КІО3, 10 крапель розчину оцтової або ортофосфорної кислоти і підігрівають суміш до температури 60 — 65 °С. Спостерігають появу забарвлення.

Реакція на адреналін з нітритно-молібденовим реактивом

Адреналін у кислому середовищі внаслідок взаємодії з нітритно-молібденовим реактивом утворює сполуку жовто-жовтогарячого кольору. Із додаванням лугу забарвлення змінюється на малиново-червоне, яке за наявності соляної кислоти переходить у лимонно-жовте.

У пробірку вносять 5 крапель 0,1 %-го розчину адреналіну, додають 5 крапель 5 %-го розчину соляної кислоти, 5 крапель нітритно-молібденового реактиву. Суміш перемішують і спостерігають появу забарвлення. Потім вносять 1 краплю 10 %-го розчину гідроксиду натрію, перемішують, додають 1—2 краплі концентрованої соляної кислоти, спостерігають зміни забарвлення на кожному етапі досліду.

Визначення адреналіну за флуоресценцією продуктів його окиснення

Адреналін окиснюється під впливом лугів з утворенням сполук, для яких характерна зелена флуоресценція.

У пробірку вносять 0,5 мл дистильованої води, 5 крапель 10 %-го розчину гідроксиду натрію, 5 крапель 0,1 %-го розчину адреналіну, перемішують. Спостерігають появу флуоресценції за допомогою флуорометра.

Визначення адреналіну за утворенням флуоресціювального продукту його окиснення — адренолютину

Адреналін окиснюється під дією гексаціаноферату (III) калію в адренохром, з якого в лужному середовищі утворюється адренолютин, що має жовто-зелену флуоресценцію:

адреналін    адренохром  адренолютин

У дві пробірки вносять по 1 краплі 0,1 %-го розчину адреналіну і додають в одну з них 5, а в іншу — 10 мл води, перемішують. Із цих пробірок у дві інші пробірки відмірюють по 2 мл розведених розчинів адреналіну, доливають по 0,3 мл 0,2 %-го розчину гексаціаноферату (III) калію і залишають на 5 хв (при цьому адреналін окиснюється в адренохром). У кожну пробірку додають на кінчику скальпеля кристалічну аскорбінову кислоту та по 2 мл розчину 10 %-го розчину гідроксиду натрію (аскорбінова кислота перешкоджає подальшому окисненню адренохрому, а натрію гідроксид сприяє перетворенню його в адренолютин). Пробірки розміщують у штативі флуориметра і порівнюють інтенсивність флуоресценції в пробах.

13.4. Утворення феноляту фолікуліну

Матеріали та реактиви: 1 %-й спиртовий розчин фолікуліну,
30 %-й розчин NaOH.

Порядок виконання роботи

Естрон (фолікулін) має у своєму складі фенольний гідроксил. У лужному середовищі утворюється розчинний у воді фенолят фолікуліну.

У дві сухі пробірки вливають по 0,5 мл спиртового розчину фолікуліну. В одну з них додають 1 мл води і спостерігають утворення емульсії фолікуліну (розчин каламутніє). У другу пробірку додають 1 мл 30 %-го розчину NaOH — каламуть не з'являється, оскільки в лужному середовищі утворюється розчинний фенолят фолікуліну.

13.5. Якісна реакція на 11-дегідро-17-оксикортикостерон (кортизон)

Матеріали та реактиви: 1 %-й спиртовий розчин кортизону (кортизон-ацетату), реактив Фелінга (див. лабораторну роботу 2).

Порядок виконання роботи

Кортизон може відновлювати Сu +2 до Сu +1, тому його можна виявити реакцією з реактивом Фелінга.

До 1 мл 1 %-го спиртового розчину кортизону (кортизон-ацетату) додають 1 мл реактиву Фелінга і нагрівають на водяній бані (80 —
90 °С). Спостерігають утворення осаду оксиду міді (І) цегляного кольору.

13.6. Якісні реакції на 17-кетостероїди

Матеріали та реактиви: 2 %-й спиртовий розчин м-динітробензолу, 30 %-й розчин гідроксиду натрію, 1 %-й спиртовий розчин естрону, 1 %-й спиртовий розчин андростану, сеча.

Порядок виконання роботи

У лужному середовищі 17-кетостероїди утворюють з м-динітробензеном продукти конденсації фіолетово-рожевого, вишнево-червоного кольору з максимумом світлопоглинання за довжини хвилі 530 нм. Інтенсивність забарвлення пропорційна кількості 17-кетостероїдів у сечі.

В одну пробірку вносять 5 крапель 1 %-го спиртового розчину фолікуліну, у другу — 5 крапель 1 %-го спиртового розчину андростану, у третю — 5 крапель сечі. У кожну пробірку додають 5 крапель 30 %-го розчину гідроксиду натрію і 5 крапель 2 %-го спиртового розчину м-динітробензолу. Пробірки струшують і спостерігають появу забарвлення через 2—3 хв.

Оброблення експериментальних даних

Побудуйте таблицю, у якій наведіть: відомі вам гормони; укажіть їх біологічну роль, хімічну природу, ендокринну залозу, що їх виробляє.

Зробіть висновок про вміст певних амінокислотних залишків у молекулі інсуліну. Порівняйте методи виявлення адреналіну.

Контрольні запитання та завдання

1. Як класифікують гормони за їх хімічною будовою? Наведіть приклади.

2. Які гормони називають справжніми (істинними)? Якими залозами внутрішньої секреції вони воробляються?

3. Який механізм дії гормонів ліпідної природи та тиреоїдних гормонів?

4. Який механізм дії гормонів білкової, пептидної природи та похідних амінокислот?

5. Напишіть схему каскадного механізму гормональної активації ферменту за участі циклічного АМФ (на прикладі глікогенфосфорилази).

6. Які гормони називаються тканинними (гістогормонами)? Яка їх хімічна природа?

7. Назвіть йодовмісні гормони щитоподібної залози. Напишіть формулу амінокислоти, з якої вони синтезуються.

8. Наведіть визначення енольного гідроксилу, фенольного гідроксилу. Напишіть реакцію фенолу з FeCl3. Який гормон має фенольний гідроксил?

9. Поясніть принцип якісних реакцій на адреналін.

10. Що називається 17-кетостероїдами? Як можна їх виявити в біологічних рідинах?

11. Як можна виявити гормони білкової природи в розчинах?

12. Напишіть структурні формули стерану, холестерину.

13. Як розрізняються між собою за будовою кортикостероїди, статеві гормони?

14. Які особливості будови фолікуліну дозволяють виявляти його якісними реакціями?

Література: [1; 4—7].