ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 1. ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ - 2011

ЧАСТЬ I. СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ

11. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ И ТРАНСПОРТ

Вопросы и задачи

Определение площади поперечного сечения липидной молекулы.

Когда фосфолипиды осторожно наслаивают на поверхность воды, они ориентируются на поверхности раздела вода-воздух таким образом, что их полярные «головки» обращены в воду, а гидрофобные «хвосты» — в воздух. Был создан прибор (а), который уменьшает площадь поверхности, доступную липидному слою. Измеряя силу, необходимую для того, чтобы стянуть липиды вместе, возможно определить, когда молекулы тесно упакованы в непрерывный монослой. Когда эта область достигается, сила, требуемая для дальнейшего уменьшения площади поверхности, резко увеличивается (б). Как бы вы использовали этот прибор для определения средней площади, занимаемой единичной липидной молекулой в монослое?

    Доказательство в пользу существования липидного бислоя.

    В 1925 г. Э. Гортер и Ф. Грендел использовали прибор, подобный описанному в задаче 1, для того чтобы определить площадь поверхности липидного монослоя, образованного липидами, экстрагированными из эритроцитов животных различных видов. Они использовали микроскоп для измерения размеров отдельных клеток и рассчитали среднюю площадь поверхности одного эритроцита. Они получили данные, представленные в таблице. Были ли эти исследователи правы, сделав вывод, что «хромоциты» (эритроциты) покрыты слоем жирных веществ, толщина которого составляет две молекулы» (т. е. липидным бислоем)?


    Объем упакованных

    клеток

    Число клеток

    Общая площадь поверхности

    Липидного монослоя

    Общая площадь поверхности

    Одной клетки

    Животные

    (мл)

    (на мм3)

    клеток (м2)

    (мкм2)

    Собака

    40

    8 000 000

    62

    98

    Овца

    10

    9 900 000

    6,0

    29.8

    Человек

    1

    4 740 000

    0,92

    99,4

      Число молекул детергента в мицелле.

      Когда небольшое количество додецилсульфата натрия (SDS; Na+CH3(CH2)11ОSО3-) растворяется в воде, ионы детергента поступают в раствор в виде мономерных частиц. При дальнейшем добавлении детергента достигается концентрация (критическая концентрация мицеллообразования), при которой мономеры ассоциируют, образуя мицеллы. Критическая концентрация SDS составляет 8,2 мМ. Мицеллы имеют среднюю молекулярную массу частицы (сумма молекулярных масс составляющих мономеров) -18 000. Рассчитайте среднее число молекул детергента в мицелле.

        Свойства липидов и липидных бислоев.

        Липидные бислои, образованные между двумя водными фазами, обладают следующим важным свойством: они образуют двумерные пластинки, края которых находятся очень близко друг к другy, и подвергаются самоуплотнению, формируя липосомы. (а) Какие свойства липидов ответственны за это свойство бислоев? Объясните, (б) Каковы последствия этого свойства для структуры биологических мембран?

          Длина молекулы жирной кислоты.

          Расстояние углерод-углерод для одинарной связи (как в ацильной цепи насыщенной жирной кислоты) составляет 1,5 А. Оцените длину отдельной молекулы пальмитиновой кислоты в ее полностью вытянутой форме. Если две молекулы пальмитиновой кислоты поместить конец к концу, какова будет их общая длина по сравнению с толщиной липидного бислоя в биологической мембране?

            Температурная зависимость латеральной диффузии.

            Эксперимент, описанный на рис. 11-17, проводился при 37 °С. Каково было бы влияние на скорость диффузии, если бы эксперимент проводили при 10 °С?

              Синтез желудочного сока: энергетика.

              Желудочный сок (pH 1,5) производится перекачиванием ионов H+ и Сl- из плазмы крови (pH 7,4) в желудок. Рассчитайте количество свободной энергии, необходимой для концентрирования H+ в 1 л желудочного сока при 37 °С. Сколько молекул АТР нужно гидролизовать для производства такого количества свободной энергии в условиях клетки? Изменение свободной энергии для гидролиза АТР в условиях клетки составляет около -58 кДж/моль (как показано в гл. 13). Эффекты трансмембранного электрического потенциала во внимание не принимайте.

                Энергетика Na++-АТРазы.

                Каково изменение свободной энергии переноса 1 моль Na+ из клетки и в кровь при 37 °С для типичной клетки позвоночного с трансмембранным потенциалом, составляющим -0,07 В (отрицательный внутри)? Примем концентрацию Na+ внутри клетки равной 12 мМ, а в плазме крови — 145 мМ.

                  Действие оуабаина на ткань почки.

                  Оуабаин специфически ингибирует активность Na+/K+- АТРазы животных тканей. Неизвестно ингибирование оуабаином какого-либо другого фермента. Когда оуабаин добавляют к тонким срезам живой почечной ткани, он ингибирует поглощение кислорода на 66%. Почему? Что может нам рассказать это наблюдение об использовании энергии дыхания почечной тканью?

                    Энергетика симпорта.

                    Предположим, вы экспериментально определили, что клеточная система транспорта глюкозы, приводимая в действие симпортом Na+, может накапливать глюкозу в концентрациях, в 25 раз превышающих таковые во внешней среде, в то время как внешняя [Na+] была только в 10 раз больше, чем внутриклеточная [Na+]. Не нарушает ли это законов термодинамики? Если нет, какое объяснение вы могли бы дать этому наблюдению?

                      Локализация мембранного белка.

                      Относительно неизвестного мембранного белка X сделаны следующие наблюдения. Его можно экстрагировать из разрушенных мембран эритроцитов в концентрированный солевой раствор, он также может расщепляться на фрагменты протеолитическими ферментами. В результате обработки эритроцитов протеолитическими ферментами и последующих разрушения и экстракции мембранных компонентов получается интактный X. Однако обработка теней эритроцитов (которые как раз и состоят из плазматической мембраны, получающейся путем разрушения клеток и отмывания от гемоглобина протеолитическими ферментами с последующими разрушением и экстракцией) дает в значительной степени фрагментированный X. На что указывают эти наблюдения относитель

                      но локализации X в плазматической мембране? Для интегрального или для периферического белка характерны эти свойства X?

                        Самовосстановление мембраны.

                        Клеточные мембраны являются самовосстанавливающимися — если их проколоть или механически разрушить, они быстро и самопроизвольно «затягивают раны». Какие свойства мембран отвечают за это важное качество?

                          Температуры плавления липидов.

                          Мембранные липиды в образцах ткани, полученных из разных частей ноги северного оленя, имеют разный состав жирных кислот. Мембранные липиды из ткани около копыта имеют более высокое содержание ненасыщенных жирных кислот, чем липиды из ткани в верхней части ноги. Каково значение этого факта?

                            Флип-флоп-диффузия.

                            Внутренний монослой мембраны эритроцитов человека состоит преимущественно из фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина. Наружный монослой состоит в основном из фосфатидилхолина и сфингомиелина. Хотя фосфолипидные компоненты мембраны способны диффундировать в жидком бислое, эта асимметрия все время поддерживается. Как?

                              Проницаемость мембраны.

                              При pH 7 триптофан пересекает липидный бислой со скоростью, составляющей примерно одну тысячную скорости для близкородственного вещества индола:

                              Предложите объяснение этого наблюдения.

                                Перенос воды аквапоринами.

                                В каждом эритроците человечка - 2 • 105 мономеров АQР-1. Если молекулы воды текут через плазматическую мембрану со скоростью 5 • 108 на тетрамер АQР-1 в секунду, а объем эритроцита составляет 5 • 10-11 мл, как быстро объем эритроцита уменьшится наполовину при высокой осмолярности (1 М), которую он встречает в тканевой жидкости мозгового слоя почки? Считайте, что эритроцит целиком состоит из воды.

                                  Маркировка переносчика лактозы.

                                  Бактериальный транспортер лактозы, который высоко- специфичен к своему субстрату лактозе, содержит остаток Суs, необходимый для его транспортной активности. Ковалентная реакция N-этилмалеимида (NЕМ) с этим остатком Суs необратимо инактивирует транспортер. Высокая концентрация лактозы в среде препятствует такой инактивации, вероятно, благодаря стерической защите остатка Суs, который находится в связывающем лактозу сайте или около него. Вы ничего больше не знаете о белке-транспортере. Предложите эксперимент, который дат бы вам возможность определить Мr Суs-содержащего полипептида транспортера.

                                    Предсказание топологии мембранного белка по аминокислотной последовательности.

                                    Вы клонировали ген белка эритроцитов человека, который, как вы подозреваете, является мембранным белком. Из нуклеотидной последовательности гена вы знаете аминокислотную последовательность. Как вы оцените только по последовательности возможность того, что этот белок является интегральным? Предположим, белок окажется интегральным белком типа I или II. Предложите биохимические или химические эксперименты, которые позволят определить тип белка.

                                      Поглощение лейцина в кишечнике.

                                      Вы изучаете поглощение L-лейцина эпителиальными клетками кишечника мыши. Измерения скорости поглощения L-лейцина и нескольких его аналогов с Na+ в буфере и без него дают результаты, представленные в таблице. Какой вывод вы можете сделать о свойствах и механизме действия переносчика лейцина? Ожидаете ли вы, что поглощение L-лейцина будет ингибироваться оуабаином?


                                      Поглощение в присутствии Na+

                                      Поглощение в отсутствие Na+

                                      Субстрат

                                        Vmax       Kt (мМ)

                                        Vmax      Кt (мМ)

                                      L-лейцин

                                        420       0,24

                                         23      0,2

                                      D-лейцин

                                        310       4,7

                                         5      4,7

                                      L-валин

                                        225       0,31

                                         19      0,31

                                        Влияние ионофора на активный транспорт.

                                        Рассмотрите транспортер лейцина, описанный в задаче 19. Будут ли изменяться Рmах и/или Кt, если вы добавите ионофор Na+ в исследуемый раствор, содержащий Na+? Объясните.

                                          Поверхностная плотность мембранного белка.

                                          Клетка Е. coli может быть индуцирована для производства около 10 000 копий транспортера лактозы (Мr = 31 000) на клетку Примите, что Е. coli — цилиндр с диаметром 1 мкм и длиной 2 мкм. Какая часть поверхности плазматической мембраны занята молекулами транспортера лактозы? Объясните, как вы сделали свой вывод.

                                            Кольцевая диаграмма спирали.

                                            Кольцевая диаграмма представляет собой двумерное изображение спирали при взгляде вдоль ее центральной оси (см. рис. 11-29, б, а также рис. 4-4, г). Используйте представленную ниже диаграмму для определения распределения аминокислотных остатков в спиральном участке со следующей последовательностью:

                                            -Val-Asp-Arg-Val-Phe-Ser-Asn-Val-Cys-Thr- His-Keu-Kys-Thr Беи Gin-Asp Lys-.

                                            Что можно сказать о свойствах поверхности этой спирали? Как эта спираль должна быть ориентирована в пространственной структуре интегрального мембранного белка?

                                              Типы молекул в мембранеЕ.coli.

                                              Плазматическая мембрана Е. coli приблизительно на 75% по массе состоит из белка, а на 25% — из фосфолипидов. Сколько молекул мембранных липидов приходится на каждую молекулу мембранного белка? Примите среднюю молекулярную массу белка Мr = 50 000, а среднюю массу фосфолипида Мr = 750. Какой дополнительной информацией нужно обладать, чтобы оценить долю поверхности мембраны, покрытой липидами?

                                              Биохимия в Интернете

                                                Топология мембранного белка.

                                                Рецептор гормона адреналина в клетках животных является интегральным мембранным белком (Мr = 64 000), который, как принято считать, имеет семь пронизывющих мембрану областей.

                                                а) Покажите, что белок такого размера способен пересекать мембрану семь раз.

                                                б) Дана аминокислотная последовательность этого белка. Как вы предскажете, какие области белка образуют пронизывающие мембрану спирали?

                                                в) Отправимся в банк данных по белкам (www.rcsb.org). Используйте PDB- идентификатор 1DЕР, чтобы найти страницу данных для части β-адрснергичсского рецептора (один из типов рецептора адреналин индюка. Используя Jmol для выяснения структуры, предскажите, где локализована эта часть рецептора: внутри мембраны или на мембранной поверхности. Объясните.

                                                г) Найдите данные для части другого рецептора — ацетилхолинового рецептора нейронов и миоцитов, используя PDB-идентификатор 1А11. Как и для (в), предскажите, где локализована эта часть рецептора, и объясните свой ответ.

                                                Если вы еще не пользовались PDB, см. подробную информацию в доп. 4-4 (с. 193).

                                                Анализ экспериментальных данных

                                                  Жидкостно-мозаичная модель структуры биологической мембраны.

                                                  На рис. 11-3 представлена общепринятая сегодня жидкостномозаичная модель структуры биологической мембраны. Эта модель в подробном виде была описана в обзорной статье С. Дж. Зингера в 1971 г. Всего в статье были описаны три существовавшие в то время модели мембраны:

                                                  Модель Девсона-Даниелли-Робертсона.

                                                  В 1971 г. она была наиболее популярна. В соответствии с этой моделью фосфолипиды образуют двойной слой. Белки располагаются на обеих поверхностях двойного слоя, прикрепляясь к нему посредством ионных взаимодействий между заряженными «головками» фосфолипидов и заряженными группами белков. Важно, что в рамках этой модели внутри двойного слоя белков нет.

                                                  Б. Модель Бенсона (модель липопротеиновых субъединиц). В данном случае белки считаются глобулярными, а мембрана представляет собой белково-липидную смесь. Гидрофобные «хвосты» липидов внедряются внутрь гидрофобных участков белков. «Головки» липидов направлены в сторону раствора. Двойного липидного слоя нет.

                                                    Мозаичная модель мембраны из липидов и глобулярных белков.Эта модель изображена на рис. 11-3. Липиды образуют двойной слой, внутрь которого встроены белки, причем некоторые выходят за пределы двойного слоя, а некоторые нет. Белки удерживаются в двойном слое за счет гидрофобных взаимодействий между гидрофобными «хвостами» липидов и гидрофобными участками белков. Изучите приведенные ниже данные и определите, насколько они соответствуют каждой модели структуры мембраны. Какая модель или какие модели подтверждаются, а какие нет? С какими оговорками можно принять представленные данные и их интерпретацию? Объясните свои рассуждения.

                                                    а) Когда клетки фиксировали, окрашивали с помощью тетраоксида осмия и анализировали под электронным микроскопом, они выглядели, как «железнодорожные пути»: две темные линии, разделенные светлым промежутком (см. рис. 11-1).

                                                    б) Толщина мембран клеток, фиксированных и окрашенных таким образом, составляла от 5 до 9 нм. Толщина двойного фосфолипидного слоя без вкраплений белков составляла от 4 до 4,5 нм. Толщина одного монослоя белка равна ~1 нм.

                                                    в) Зингер писал: «Средний аминокислотный состав мембранных белков неотличим от состава растворимых белков. В частности, значительную долю составляют гидрофобные остатки» (с. 165).

                                                    г) Как было описано в задачах 1 и 2 данной главы, исследователи экстрагировали клеточные мембраны, выделяли липиды и сравнивали площадь монослоя липидов с площадью исходной клеточной мембраны. Интерпретация результатов усложнялась обстоятельством, проиллюстрированным на графике в задаче 1: площадь монослоя зависит от того, какое давление на него оказывают. При очень слабом давлении отношение площади монослоя к площади клеточной мембраны составляло 2,0. При более высоком давлении, которое, как считалось, с большей вероятностью реализуется в клетке, это отношение было значительно меньше.

                                                    д) Метод кругового дихроизма на основании изменений поляризации УФ-света позволяет сделать выводы о вторичной структуре белка (см. рис. 4-9). Метод показал, что в мембранных белках достаточно большое количество α-спиралей и мало β-слоев. Эти данные соответствуют тому факту, что большинство мембранных белков имеют глобулярную структуру.

                                                    с) Фосфолипаза С — фермент, который удаляет полярные головки (включая фосфатные группы) фосфолипидов. В некоторых работах сообщалось о том, что обработка интактных мембран фосфолипазой С приводила к удалению около 70% полярных головок без разрушения структуры «железнодорожных рельсов».

                                                    ж) Зингер описал одно исследование, в котором «гликопротеин с молекулярной массой 31 000 в мембранах красных кровяных клеток человека расщепляли трипсином до образования растворимых гликопептидов с молекулярной массой около 10 000, при этом оставшаяся часть гликопротеина была достаточно гидрофобной» (с. 199). Обработка трипсином не вызывала больших изменений в структуре мембран, которые оставались целыми. В обзоре Зингера рассматривались и другие работы на эту тему. Однако имевшиеся в 1971 г. данные не указывали однозначно на справедливость модели В. Эта модель стала общепринятой лишь позднее, когда появились дополнительные данные исследований.