БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина І. Загальна біотехнологія

РОЗДІЛ 5. ОСНОВИ ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

5.1.БІОТЕХНОЛОГІЯ КОНСТРУЮВАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ДНК

5.1.1.Одержання фрагментів ДНК

Вивчення загальних біохімічних властивостей клітинної ДНК хоча й давало певну інформацію, однак установити деталі її генетичної організації було неможливо. У середині 70-х років ХХ ст. були широко поширені два методи, використання яких істотно спростило аналіз ДНК. В основі одного з цих методів лежить відкриття гідролітичних ферментів — рестрикційних ендонуклеаз (рестриктаз), що викликають розщеплення ДНК на фрагменти в місцях, які мають специфічні нуклеотидні послідовності, що є у молекулі ДНК.

Для вирішення питань молекулярної біології рестриктази одержують з бактеріальних клітин. Так, фермент рестрикційна ендонуклеаза ЕсоRI розщеплює ДНК тільки в тих місцях, де є GAATTC-нуклеотидна послідовність; рестриктаза Smal гідролізує ДНК у місцях СССGGG-послідовності нуклеотидів, а місцем ферментативної дії BamHI є GGATTC-сполучення нуклеотидів. Другі рестриктази гідролізують інші нуклеотидні послідовності. Послідовності, які пізнаються і гідролізуються цими й іншими рестрикційними ендонуклеазами, ймовірно зустрічаються уздовж дволанцюгової структури ДНК. Ферменти рестрикції дозволяють перетворити макромолекулу ДНК у набір фрагментів, що включають від декількох сотень до декількох тисяч пар азотистих основ. Фрагменти, що розрізняються між собою за молекулярною масою, можна одержати в ізольованому вигляді за допомогою електрофорезу в гелі, а потім провести аналітичне дослідження кожного з виділених фрагментів.

Другим методичним прийомом є порівняно швидке визначення нуклеотидної послідовності утворених під впливом ре- стриктаз фрагментів ДНК і макромолекули в цілому. Однак у цьому випадку виникають певні труднощі через те, що кількість пар азотистих основ, які складають нуклеотидну послідовність ДНК, навіть у бактеріальній клітині завелика. Що стосується геному ссавців, який має набагато більший розмір, то він складається приблизно з 2,5 млрд. пар азотистих основ; останні, у свою чергу, формують окремі інформаційні блоки-гени. Кількість їх у геномі ссавців досягає 50-100 тис.

Є дані, що кожен ген визначає структуру білка. У зв’язку з цим доцільним було провести дослідження нуклеотидної послідовності в молекулі ДНК біологічних об’єктів, геном яких за розміром набагато менший, ніж геном клітини еукаріот. Об’єктами були використані віруси. У 1979 р. удалося визначити повну послідовність нуклеотидів у геномі вірусу мавп SV40. Установлено, що геном цього вірусу складається з 5243 пар азотистих основ, організованих у п’ять окремих генів. Вибір об’єкта виявився вдалим ще й тому, що аналіз окремих генів не був ускладнений присутністю великого надлишку неспоріднених послідовностей. Крім того, у клітині внаслідок розмноження вірусу одночасно знаходиться декілька сотень тисяч копій його геному, що значно полегшує процедуру відокремлення вірусної ДНК від ДНК клітини-хазяїна. Завдяки тому, що генетичний код трансляції послідовності нуклеотидів у послідовність амінокислот уже був розшифрований, стало можливим побудувати послідовність амінокислот у молекулах білків, що кодовані усіма п’ятьма генами вірусу SV40.

Одночасно зі з’ясуванням послідовності нуклеотидів у молекулі ДНК вірусу SV40 було знайдено ділянки, що не належать до ділянки структурного гена, тобто ділянки, що не кодують білки, а беруть участь у регуляції експресії генів і реплікації вірусної ДНК.

Молекулярні біологи розробили методи виділення генів донорських організмів, уведення генів у векторну молекулу й одержання рекомбінантних (гібридних) ДНК, забезпечення самовідтворення рекомбінантних ДНК, тобто їхньої реплікації, перенесення гібридних ДНК в організм реципієнта (клітини- хазяїна) і забезпечення експресії чужорідних генів.