Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Анализ концевых групп и ступенчатая деградация белков и пептидов
Определение N-концевой аминокислотой последовательности в реакции с фенилизотиоцианатом

Деградация с помощью фенилизотиоцианата (ФТЦ) была предложена Эдманом [4, 51. Основные стадии реакции с ФТЦ представлены на схеме (стр. 282); ФТЦ, взаимодействуя со свободными аминогруппами, образует фенилтиокарбамильное производное (ФТК-производное). Это соединение в кислой среде циклизуется с последующим отщеплением фенилтиогидантоинового производного (ФТГ-производного) N-концевой аминокислоты. Оставшаяся часть белка (или пептида) представляет собой исходное вещество, но уже без концевого остатка.

Поскольку остаток обладает новым N-концом, то, очевидно, он опять будет реагировать с ФТЦ. В результате на следующем этапе реакции второй остаток пептидной цепи так же образует ФТК-производное и может быть идентифицирован.

Многократное повторение реакции Эдмана, таким образом, позволяет определить N-концевую аминокислотную последовательность изучаемого пептида. Этот метод имеет исключительно большое значение при определении последовательности пептидов, изолированных из ферментативных гидролизатов, и, следовательно, при выяснении первичной структуры белков с высоким молекулярным весом.

Деградация с помощью ФТЦ проводится в несколько стадий: 1) добавление ФТЦ, 2) циклизация ФТК-производного, 3) экстрагирование свободного ФТГ-производного, 4) идентификация и определение ФТГ-производного или анализ укороченного пептида, 5) повторная деградация, идентификация и т. д. Из-за различной растворимости белков и пептидов приходится проводить реакцию Эдмана с ними в разных экспериментальных условиях.

ФТГ-производные могут быть идентифицированы прямым или непрямым путем. Прямая идентификация достигается хроматографией ФТГ-фракций. При непрямой идентификации ФТГ-производные сначала разрушают добавлением Ва(ОН)₂ или 6 н. НСl, а затем определяют полученные свободные аминокислоты. Непрямой метод непригоден для количественного анализа, так как при такой обработке происходит сильное разрушение веществ.

При изучении небольших пептидов подходящим методом аминокислотного анализа, например с помощью автоматического аминокислотного анализатора, можно достаточно определенно установить состав пептида, лишенного своей концевой группы. Проследив за изменением аминокислотного состава на последовательных этапах деградации, можно восстановить аминокислотную последовательность изучаемого пептида.

Деградацию по Эдману можно комбинировать с дансильным методом. При этом после отщепления концевого остатка определяют N-конец оставшегося пептида и воспроизводят последовательность, основываясь на данных N-концевого анализа.