Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Анализ белков с помощью низковольтного электрофореза
Низковольтный электрофорез на бумаге
Методика окрашивания

Различные методики окрашивания фиксированных нагреванием электрофореграмм позволяют не только выявить, но и количественно измерить различные белковые фракции. Кроме методик окрашивания белка, существуют также способы окрашивания липидных и углеводных компонентов липопротеидов и гликопротеидов.

ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ

ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ АМИДОВЫМ ЧЕРНЫМ

1) Очистка амидового черного [14]. 10,0 г чистого амидового черного растворяют в 900 мл дистиллированной воды, а затем осаждают, прибавив 100 мл концентрированной соляной кислоты. Надосадочную жидкость сливают, а осадок отмывают в 1000 мл 10%-ной НСl, после чего его помещают на фильтр и отмывают холодной дистиллированной водой до тех пор, пока в фильтрате не исчезнет голубое окрашивание. Затем осадок красителя переносят в химический стакан, суспендируют в дистиллированной воде и доводят pH суспензии до 6,5 с помощью NaOH. После этого нагревают до кипения, охлаждают и, проверив pH, высушивают на водяной бане. Из очищенного таким образом красителя готовят окрашивающий раствор.

2) Окрашивание по Гроссману и Ханнигу [11] (см. стр. 48).

3) Окрашивание по методу Путра [23]. Окрашивающий раствор: 1,0 г амидового черного растворяют в смеси 90 мл метанола и 10 мл ледяной уксусной кислоты.

Отмывающий раствор: 5%-ная уксусная кислота.

Методика. Фиксированные электрофореграммы сворачивают, на 2—3 мин погружают в нагреваемый на водяной бане до кипения метанол, а затем 4 мин окрашивают раствором амидового черного, имеющим температуру 80° С. После окрашивания полоски расправляют на стекле, оставляют на 5 мин и затем промывают в отмывающем растворе, нагретом до 80°С, пока не удалят избыток красителя.

ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ КИСЛЫМ ФУКСИНОМ

Окрашивающий раствор: 2,0 г кислого фуксина растворяют в смеси, состоящей из 500 мл метанола, 400 мл дистиллированной воды и 100 мл ледяной уксусной кислоты.

Дифференцирующий раствор: смешивают 500 мл метанола, 400 мл дистиллированной воды и 100 мл ледяной уксусной кислоты.

Отмывающий раствор: 10%-ная уксусная кислота.

Методика. Фиксированные нагреванием электрофореграммы на 15 мин погружают в окрашивающий раствор, а затем на 15 мин переносят в дифференцирующий раствор. После этого, каждые 20 мин меняя отмывающий раствор, электрофореграммы промывают до тех пор, пока участки бумаги, не содержащие белка, полностью не освободятся от красителя.

Возможность полного удаления не связывающегося с белком фуксина из бумаги является преимуществом этого метода, особенно удобного при количественном определении фракций с помощью элюирования (см. стр. 60). Одну и ту же порцию окрашивающего или дифференцирующего растворов можно использовать 4—5 раз. При первых отмывках новой серии электрофореграмм можно использовать последние порции отмывающего раствора из предыдущей процедуры окрашивания.

ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ БРОМФЕНОЛОВЫМ СИНИМ [3]

Окрашивающий раствор: 1%-ный раствор бромфенолового синего в этаноле, насыщенном HgCl₂.

I дифференцирующий раствор: метанол, содержащий 1% HgCl₂.

II дифференцирующий раствор: этанол, содержащий 1% HgCl₂.

Отмывающий раствор: метанол.

Методика. Фиксированные электрофореграммы на 5 мин погружают в окрашивающий раствор, переносят в I дифференцирующий раствор, а потом на 15 мин во II дифференцирующий раствор. После этого бумагу отмывают чистым метанолом. При необходимости можно очень быстро высушить электрофореграммы, погружая их в эфир и извлекая на воздух. Вместо метанола отмывающим раствором может служить 0,5%-ная уксусная кислота.

ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ ПУНЦОВЫМ КРАСНЫМ [24]

Окрашивающий раствор: насыщенный раствор пунцового красного 2R в смеси 50%-ный метанол — ледяная уксусная кислота (9:1).

Отмывающий раствор: смесь 50%-ный метанол — ледяная уксусная кислота (9:1).

Методика. Окрашивание продолжается 10 мин, затем электрофореграммы отмывают до полного удаления несвязавшегося красителя.

ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ АЗОКАРМИНОМ [17]

Окрашивающий раствор: 0,25%-ный раствор азокармина в смеси метанол — уксусная кислота (9:1).

Отмывающий раствор: смесь метанол — уксусная кислота (9:1).

Методика. Окрашивание продолжается 10 мин, затем электрофореграммы отмывают до полного удаления несвязавшегося красителя, каждые 15 мин меняя отмывающий раствор.

ОКРАШИВАНИЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ

ОКРАШИВАНИЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ СУДАНОМ ЧЕРНЫМ (МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ В НАШЕЙ ЛАБОРАТОРИИ)

Основной раствор красителя: 500 мг Судана черного 10В растворяют в 500 мл метанола.

Окрашивающий раствор: к 100 мл основного раствора красителя прибавляют 180 мл метанола и 120 мл дистиллированной воды.

Методика. Фиксированные нагреванием электрофореграммы на 60 мин погружают в окрашивающий раствор и затем отмывают в проточной водопроводной воде до полного удаления несвязавшегося красителя.

Основной и окрашивающий растворы следует хранить в темноте в плотно закупоренных бутылях и обязательно фильтровать через бумагу перед употреблением. Основной раствор лучше использовать не сразу после приготовления, а после того как он постоит 6—8 дней. Одну и ту же порцию окрашивающего раствора можно применять 4—5 раз. Затем происходит выпадение красителя в осадок, темносиний оттенок раствора становится черным, и при фильтрации гранулы красителя остаются на фильтре.

Судан черный 10В окрашивает липопротеиды в синий цвет. Обычно фон, т. е. участки электрофореграммы, не содержащие липопротеидов, не удается отмыть до абсолютно белого цвета, так как краситель нельзя полностью удалить из бумаги. Об этом не следует забывать при определении содержания липопротеидов методом элюирования (см. стр. 60).

ОКРАШИВАНИЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ СУДАНОМ ЧЕРНЫМ ПО СВАНУ [28]

Основной раствор красителя: 0,1 г чистого Судана черного растворяют в 100 мл 60%-ного этанола, подогревая на кипящей водяной бане. После охлаждения раствор красителя дважды фильтруют через мелкопористый бумажный фильтр.

Методика. Электрофореграммы на 3 ч погружают в окрашивающий раствор, затем отмывают в течение 45 мин в трех порциях 50%- ного этанола и высушивают на воздухе.

ОКРАШИВАНИЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ ЖИРОВЫМ КРАСНЫМ [12]

Окрашивающий раствор: 0,4 г чистого жирового красного растворяют в 1000 мл 60%-ного этанола, нагревая до кипения в колбе с обратным холодильником. Затем смесь оставляют на ночь при 30° С на магнитной мешалке. В заключение раствор фильтруют при 39° С.

Методика. Фиксированные нагреванием электрофореграммы на 18 ч погружают в окрашивающий раствор, нагретый до температуры 30° С, затем для удаления этанола в течение 2 мин промывают проточной водопроводной водой и высушивают при комнатной температуре. Окрашивание при температуре ниже 30° С приводит к выпадению красителя в осадок. Липопротеиды окрашиваются в красный цвет на розовом фоне.

ВЫЯВЛЕНИЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ОКРАШЕННОЙ СЫВОРОТКИ [5]

К 1 мл сыворотки в вассермановской пробирке медленно прибавляют 0,1 мл насыщенного раствора ацетилированного Судана черного В в 95%-ном этаноле, тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин. Затем удаляют избыток этанола, продувая над сывороткой воздух. Во время окрашивания возможно выпадение осадка красителя, который легко удаляется центрифугированием.

8 мкл окрашенной сыворотки наносят на полоску фильтровальной бумаги и подвергают электрофорезу в буферном растворе Михаэлиса pH 8,6, μ = 0,05. Хорошо разделившиеся фракции а- и ß-липопротеидов образуют зоны, окрашенные в синий цвет на белом фоне электрофореграммы.

Примечания. На бумаге Махери-Нагель 214 при напряжении 300 В в аппарате для зонального полумикроэлектрофореза можно полностью разделить липопротеиды за 1,5 ч.

Ацетилирование Судана черного 10В [19]. К 60 мл пиридина добавляют 40 мл уксусного ангидрида. В эту смесь вносят 2,0 г Судана черного 10В и оставляют на ночь. Затем дистиллированной водой доводят объем смеси до 3 л, собирают выпавший в осадок краситель, высушивают его и растворяют в ацетоне.

ОКРАШИВАНИЕ ГЛИКОПРОТЕИДОВ

Сывороточные гликопротеиды выявляются толуидиновым синим, который дает с ними метахроматическое окрашивание, или в цветной реакции с йодной кислотой и реактивом Шиффа (ШИК-реакция).

ОКРАШИВАНИЕ ГЛИКОПРОТЕИДОВ ТОЛУИДИНОВЫМ СИНИМ [2]

Реактивы. 1) 1, 2 г йодной кислоты растворяют в 30 мл дистиллированной воды и добавляют 15 мл 0,5 М раствора уксуснокислого натрия и 100 мл 96%-ного этанола. Этот реактив следует готовить непосредственно перед употреблением.

2) Дифференцирующий раствор: к 100 мл метанола добавляют 20 мл ледяной уксусной кислоты и 80 мл дистиллированной воды.

3) Бромная вода.

4) 1%-ный водный раствор толуидинового синего.

5) 4%-ный раствор молибденовокислого аммония.

6) Ацетон.

Методика. Фиксированные нагреванием электрофореграммы на 15 мин погружат в свежеприготовленный реактив (1), затем на 15 мин переносят в бромную воду (3). После этого электрофореграммы ополаскивают водопроводной водой и на 30 мин погружают в окрашивающий раствор толуидинового синего (4). Затем окрашивающий раствор сливают и в течение 30—40 мин электрофореграммы промывают проточной водопроводной водой до полного удаления несвязавшегося красителя. Потом их фиксируют 3 мин в растворе (5) и на 15 мин погружают в дифференцирующий раствор (2). В результате на красновато-фиолетовом фоне отчетливо видны синие фракции гликопротеидов. Окрашивание завершается двухминутным погружением в ацетон и высушиванием на воздухе.

ОКРАШИВАНИЕ ГЛИКОПРОТЕИДОВ ЙОДНОЙ КИСЛОТОЙ — РЕАКТИВОМ ШИФФА [16]

Реактивы. 1) 1,2 г йодной кислоты растворяют в 30 мл дистиллированной воды, добавляют 15 мл 0,5 М раствора уксуснокислого натрия и 100 мл этанола. Реактив готовят непосредственно перед использованием.

2) 5,0 г йодистого калия и 5,0 г тиосульфата натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды и добавляют 150 мл 96%-ного этанола и 2,5 мл 2н. соляной кислоты. Этот раствор также готовят непосредственно перед использованием.

3) 1,5 г основного фуксина растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,5 г метабисульфита калия и 3 мл концентрированной НСl. Раствор на 12 ч оставляют в холодильнике, затем смешивают его с 3—4 г угольного порошка и фильтруют через плотный бумажный фильтр. Фильтрацию повторяют до почти полного обесцвечивания фильтрата (допускается светло-розовый оттенок). Готовый раствор можно хранить 2—3 дня.

4) 0,4 г метабисульфита калия растворяют в 10 мл дистиллированной воды и добавляют 1 мл концентрированной НСl.

5) К 100 частям 40%-ного раствора формальдегида добавляют 3 части концентрированной НСl.

Методика. Фиксированные электрофореграммы да 10 мин погружают в реактив (1), а затем отмывают в 70%-ном этаноле. Потом их погружают на 8 мин в реактив (2) и снова отмывают в 70 %-ном этаноле. Затем 30 мин их окрашивают реактивом (3) и трижды по 5 мин отмывают реактивом (4). После отмывки электрофореграммы на 2 мин погружают в 0,5 н. НСl и на 20 мин помещают в реактив (5). В заключение их отмывают в течение 2 мин в ацетоне и высушивают на воздухе.

ОКРАШИВАНИЕ ГЛИКОПРОТЕИДОВ ПО ЗЮДХОФУ [27]

Реактивы. 1) 1,0 г йодной кислоты растворяют в 30 мл дистиллированной воды и добавляют 70 мл абсолютного этанола.

2) 1,0 г парафуксина растворяют в 30 мл охлажденной 1 н. НСl, при встряхивании добавляют 1 г метабисульфита калия, растворенного в 170 мл дистиллированной воды и оставляют смесь на 48 ч. Затем раствор взбалтывают с порошкообразным углем и фильтруют.

Используемый парафуксин не должен содержать акридина. Не следует применять давно приготовленный метабисульфит калия. При нарушении герметичности упаковки верхний слой реактива нужно отбрасывать.

3) Раствор смеси формальдегида и аммиака. Смешивают равные объемы 1М формальдегида и 1 н. гидроокиси аммония.

4) Дифференцирующие растворы: а) 96%-ный этанол и б) смесь этанол — 1 н. НСl (5:3).

5) Диэтиловый эфир.

Методика. Электoфореграммы 10 мин обрабатывают реактивом (1), затем 10 мин промывают проточной водопроводной водой и на 2 мин погружают в дистиллированную воду. После этого их окрашивают реактивом (2) до тех пор, пока на бесцветном фоне не появятся красные зоны гликопротеидов. Как только фон электрофореграммы начнет розоветь, полоску следует быстро перенести в реактив (3), в котором она вся приобретет красный цвет. Примерно через 1—3 мин, когда окраска достигнет максимальной интенсивности, электрофореграммы на 5 мин погружают в реактив (4а), а затем в реактив (4б), в котором происходит изменение цвета: гликопротеиды становятся красновато-лиловыми, а фон обесцвечивается. Несколькими сменами реактива (4б) добиваются полного обесцвечивания фона. После этого, чтобы удалить НСl, электрофореграммы вновь промывают реактивом (4а). В заключение их погружают в эфир и высушивают на воздухе.