Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы иммунохимического анализа
Анализ белков с помощью реакции преципитации
Качественная реакция преципитации

Принцип метода. При смешивании растворимого белкового антигена со специфической иммунной сывороткой наблюдается образование преципитата.

Область применения. Выявление специфических антител и выявление при помощи специфической иммунной сыворотки белковых антигенов, взятых в качестве иммунизирующего материала.

МЕТОДИКА

В зависимости от имеющегося в распоряжении количества иммунной сыворотки ее разливают в пробирки по 0,1— 0,5 мл. В каждую пробирку вносят равный объем раствора антигена — в первую пробирку неразведенный, а в последующие с возрастающим разведением (1 : 2, 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16 и т. д.). После перемешивания растворов пробирки инкубируют в водяной бане при 37°С 60 мин. Если сыворотка достаточно активна, то уже на этом этапе появляются ясно различимые преципитаты. После инкубации пробирки оставляют до следующего дня в холодильнике. При использовании слабых иммунных сывороток преципитаты можно обнаружить после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин.

Контроль I: к 0,1—0,5 мл 0,9%-ного раствора NaCl добавляют равное количество раствора антигена так же, как в опытной пробе.

Контроль II: к 0,1—0,5 мл иммунной сыворотки добавляют 0,9%-ный раствор NaCl в том же объеме, в каком добавляли антиген в опытной пробе.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Реакция считается положительной, если в пробирке образуется преципитат. В случае известной иммунной сыворотки это указывает на присутствие соответствующего белкового антигена; в случае известного белкового антигена — на присутствие специфических антител в исследуемой антисыворотке.

2. Реакция считается отрицательной, если преципитат не образовался. Это может означать, что: 1) в исследуемой системе отсутствует антиген, к которому специфична применяемая антисыворотка; 2) в антисыворотке отсутствуют антитела к данному антигену; 3) в системе имеется избыток антигена, растворяющего преципитат. Чтобы избежать ошибочной оценки реакции из-за растворения преципитата в избытке специфического антигена, следует к одному и тому же объему антисыворотки прибавлять раствор антигена с возрастающим разведением или постепенно уменьшать его количество.

3. В принципе для образования видимого преципитата достаточно, чтобы в реакции участвовало 0,1—0,5 мг азота антител. При меньшем количестве антител преципитат можно еще выявить, отцентрифугировав реакционную смесь. Однако если количество азота антител меньше 0,01 мг, то реакция преципитации не происходит.

4. Если в распоряжении исследователя имеется ограниченное количество иммунной сыворотки, то реакцию преципитации можно поставить следующим образом. В центрифужную пробирку вносят 0,1—0,5 мл этой сыворотки, затем к ней добавляют 0,01 мл раствора антигена, перемешивают и оставляют на 30 мин при 37°С. Если преципитат не образуется, к реакционной смеси добавляют еще 0,03 мл раствора антигена и продолжают инкубацию еще 30 мин. В ожидании появления преципитата можно и дальше повторять эту процедуру, добавляя возрастающие количества антигена (0,1; 0;3; 1,0 мл и т. д.).

5. Центрифугируя реакционную смесь при положительной реакции преципитации, можно удалить образовавшийся преципитат и определить, какой из двух компонентов системы, антиген или антитело, остался в надосадочной жидкости. Тем самым удается выяснить, в избытке какого компонента проходила реакция. Для этого половину надосадочной жидкости смешивают с равным объемом иммунной сыворотки, а к другой половине добавляют возрастающие количества раствора антигена (см. предыдущий раздел). Образование преципитата в первом случае свидетельствует об избытке антигена, во втором — об избытке антител. Подобным образом можно определить оптимальное соотношение антиген — антитело для положительной реакции преципитации.