Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы иммунохимического анализа
Анализ белков с помощью реакции преципитации
Определение титра преципитирующих антител по разведения антигена

Принцип метода. При внесении в специфическую иммунную сыворотку растворимого белкового антигена происходит реакция преципитации. Количество преципитирующих антител в неразведенной или в разведенной в 10 раз антисыворотке можно охарактеризовать тем наибольшим разведением антигена, которое еще способно вызвать реакцию преципитации с данной сывороткой; это разведение называется титром преципитинов.

МЕТОДИКА

1. Приготовление серийных разведений антигена. В зависимости от того, сколько сыворотки имеется в распоряжении исследователя, готовят серию двукратных, четырехкратных или десятикратных разведений антигена. При подготовке серии двукратных разведений антигена в штатив помещают 16 вассермановских пробирок; в первую наливают 0,5 мл неразведенного антигена, а во все остальные — по 0,5 мл 0,9%-ного раствора NaCl. Во вторую пробирку вносят 0,5 мл неразведенного антигена и после перемешивания 0,5 мл смеси переносят пипеткой в третью пробирку. Смешав содержимое третьей пробирки, 0,5 мл переносят в четвертую и т. д. до конца ряда. Из последней пробирки отбирают 0,5 мл и выбрасывают. Таким образом получается серия разведений раствора антигена от исходного до разведенного в соотношении 1 : 32 768. (Меняя аликвоты растворов антигена и хлористого натрия, можно подобным образом приготовить серии разведений другой кратности.)

2. Добавление иммунной сыворотки. В каждую пробирку с раствором разведенного антигена добавляют равные объемы неразведенной или разведенной в 10 раз иммунной сыворотки.

3. Контрольные пробы. Контроль I: 0,5 мл иммунной сыворотки смешивают с равным объемом 0,9%-ного раствора NaCl. Контроль II: 0,5 мл 0,9%-ного раствора NaCl смешивают с равным объемом раствора антигена.

4. Инкубация и учет результатов реакции. Перемешав растворы, пробирки инкубируют при 37°С в течение 60 мин, затем их переносят в холодильник и учитывают результаты реакции на следующий день. Титром преципитинов считается то наибольшее разведение антигена, при котором еще образуется преципитат с исследуемой иммунной сывороткой.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Иммунные сыворотки, которые готовят для иммунохимического анализа белков, должны преципитировать соответствующие белковые антигены, разведенные не менее чем в соотношении 1 : 10 000 — 50 000.

2. Недостаток данного метода заключается в том, что требуются относительно большие количества исследуемого материала. Если исследователь располагает небольшими количествами антигена или антисыворотки, можно уменьшить объемы компонентов системы до 0,2 мл или воспользоваться другим методом, требующим меньших количеств компонентов.

3. Для успешного проведения ряда иммунохимических исследований необходимо, чтобы реакция преципитации осуществлялась в так называемой зоне эквивалентности, т. е. при оптимальных количественных соотношениях антигенов и антител, вступающих в реакцию. С помощью метода разведений, описанного выше, эту зону можно определить следующим образом. Готовят ряд двукратных разведений иммунной сыворотки в объеме 0,2—0,5 мл и в каждую пробирку вносят равный объем раствора антигена в том разведении, при котором еще происходит реакция преципитации. Пробирки инкубируют при 37°С в течение 60 мин, оставляют на ночь в холодильнике и учитывают реакцию на следующий день. При этом определяют наибольшее разведение иммунной сыворотки, при котором еще образуется преципитат со взятым по титру антигеном. Считается, что в этих условиях реакция преципитации протекает в зоне эквивалентности.