Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы иммунохимического анализа
Анализ белков с помощью реакции преципитации
Количественная реакция преципитации по Хайдельбергеру

Принцип метода. Если реакция преципитации происходит в зоне эквивалентности, то, определив азот преципитата, можно вычислить соотношение реагирующих компонентов. Вычитая из количества азота преципитата известное количество азота антигена, можно вычислить количество азота антител в исследуемой иммунной сыворотке.

Область применения. Определение азота антител в исследуемых иммунных сыворотках с помощью раствора антигенов известной концентрации. Определение концентрации белковых антигенов при помощи антисывороток с известной концентрацией азота антител.

МЕТОДИКА

1. Определение оптимального соотношения антиген — антитело. Зону эквивалентности антиген —антитело определяют в предварительных экспериментах (см. стр. 123).

2. Постановка реакции, инкубация. Определив зону эквивалентности, в 5 центрифужных пробирок наливают по 1 мл исследуемой иммунной сыворотки и добавляют раствор антигена в возрастающих концентрациях. Концентрация добавляемого антигена должна быть известна из предварительных опытов. Антиген и иммунную сыворотку осторожно перемешивают, вращая каждую пробирку между ладонями, инкубируют 1 ч при 37°С и на 24 ч оставляют в холодильнике.

3. Центрифугирование и отмывание преципитата. После того как реакция преципитации закончится, образовавшийся преципитат осаждают центрифугированием при 2000 об/мин в течение 60 мин.

Надосадочную жидкость (I) осторожно сливают, следя за тем, чтобы в нее не попали фрагменты преципитата. Если нет уверенности в том, что преципитат достаточно хорошо осел, надосадочную жидкость следует не сливать, а отсасывать. После удаления надосадочной жидкости центрифужные пробирки перевертывают вверх дном и ставят вертикально на фильтровальную бумагу.

К осадку добавляют 0,5 мл охлажденного 0,9%-ного раствора NaCl и энергично встряхивают пробирку, суспендируя преципитат. Затем тем же раствором (2,5 мл) смывают частички преципитата со стенок пробирки (общий объем пробы будет 3 мл). Суспендированный преципитат вновь центрифугируют при 2000 об/мин, надосадочную жидкость сливают, а отмывание повторяют еще раз.

4. Растворение преципитата. К дважды отмытому преципитату добавляют несколько капель дистиллированной воды и 1 каплю 0,5 М раствора NaOH. После растворения преципитата в полученном растворе определяют содержание азота одним из соответствующих методов.

5. Определение зоны эквивалентности. Чтобы определить, в какой из пяти пробирок реакция преципитации действительно проходила в зоне эквивалентности, в надосадочной жидкости каждой пробы (1) определяют избыток антигена или антител, добавляя соответственно иммунную сыворотку или раствор антигена (см. стр. 120).

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Преципитация обычно максимальна в тех пробирках, надосадочная жидкость (I) которых содержит небольшой избыток антигена. Можно определить количество азота антител в исследуемой антисыворотке, если вычесть известное количество азота антигена из количества азота в преципитате такой пробы. Результаты обычно выражают количеством азота антител в 1 мл иммунной сыворотки.

2. Результаты количественной реакции преципитации можно выразить графически, построив кривую зависимости количества азота преципитата от количества добавляемого антигена. Полученную кривую можно разделить на три части. Первая часть кривой — зона избытка антител. В соответствующих пробирках комплексы антиген — антитело образуют преципитат, который осаждается центрифугированием, а в надосадочной жидкости можно обнаружить свободные молекулы антител. Вторая часть кривой (ее вершина) — зона эквивалентности. Надосадочная жидкость в соответствующих пробирках не содержит ни свободного антигена, ни свободных антител. Третья часть кривой — зона избытка антигена; надосадочная жидкость в соответствующих пробирках содержит несвязанные молекулы антигена. С увеличением количества добавляемого антигена количество азота преципитата начинает уменьшаться. Дальнейшее увеличение концентрации антигена может привести к еще большему растворению преципитата вплоть до полного перехода его в раствор.

3. Необходимые для постановки этой реакции количества антигена и антисыворотки зависят от чувствительности выбранного метода определения белка. Так, например, при использовании микрометода Кьельдаля в модификации Маркхема вполне достаточно, чтобы иммунная сыворотка содержала 75—125 мкг азота антител. При использовании биуретовой реакции требуется вдвое большее содержание азота антител. В то же время, если белок определять спектрофотометрически, в реакции может участвовать половина указанного количества антител, а при определении методом Фолина — Чиокальтеу или нингидриновой реакцией достаточно одной трети этого количества. В соответствии с этим объем иммунной сыворотки в центрифужной пробирке может варьировать от 0,5 до 4,0 мл.

4. Во избежание денатурации белков рекомендуется использовать центрифугу с охлаждением.