Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы иммунохимического анализа
Анализ белков методами диффузии в геле
Метод простой линейной диффузии в геле по Удену

Принцип метода. Растворимый антиген диффундирует в агаровом геле, содержащем иммунную сыворотку. В том участке геля, где возникает его относительный избыток, в агаре образуется полоса преципитации.

Область применения. Определение концентрации растворимых белковых антигенов. Определение минимального числа антигенных компонентов, выявляемых данной антисывороткой в смеси белков.

ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ

1. Пробирки длиной 60—80 мм и диаметром 2—3 мм.

2. Капиллярные (пастеровские) пипетки.

МЕТОДИКА

1. Очистка агара. Для реакции следует использовать очищенный агар хорошего качества. Если агар не достаточно очищен, рекомендуется обработать его следующим образом.

30,0 г агара, обычно используемого для приготовления питательных сред, растворяют в 400 мл нейтральной дистиллированной воды, нагревая в кипящей водяной бане, и, как только агар растворится, выливают раствор в кювету. После охлаждения затвердевший агар разрезают на небольшие кубики, которые в течение 3 дней промывают проточной водопроводной водой, а в следующие 3 дня — нейтральной дистиллированной водой. Дистиллированную воду следует менять не реже двух раз в день. Отмытые кубики агара вновь расплавляют в конической колбе, нагревая на водяной бане, разливают по флаконам и хранят до использования в холодильнике.

2. Приготовление агарового геля. Перед использованием отмытого агара в нем определяют содержание сухого вещества. Для этого, тщательно взвесив чашку Петри, в нее наливают 10 мл расплавленного агара. После затвердения агар высушивают в сушильном шкафу при 100°С в течение примерно 12 ч. После охлаждения чашку Петри вновь взвешивают и вычисляют концентрацию агара в отмытом геле. (Если, например, чашка Петри до внесения 10 мл агара весила 50,0 г, а после высушивания в ней агара весит 50,5 г, то, следовательно, внесенный раствор агара имел концентрацию 5%.) Зная эту величину, отмытый агар расплавляют и 0,9%-ным раствором NaCl доводят до нужной концентрации, прибавив в качестве консерванта 0,01% мертиолата.

3. Нанесение агара на внутреннюю поверхность пробирок. Чтобы покрыть внутреннюю поверхность пробирок тонким слоем агара, их заполняют 0,1%-ным расплавленным агаром с помощью капиллярной пипетки и сразу же после заполнения агар сливают. Агаровые пленки высушивают, поместив пробирки в эксикатор.

4. Постановка реакции. 0,6%-ный агар, расплавленный в физиологическом растворе, охлаждают до температуры 46—48°С и смешивают с равным объемом иммунной сыворотки, нагретой до этой же температуры. С помощью капиллярной пипетки расплавленную смесь агара и антисыворотки вносят в пробирки, покрытые изнутри сухой агаровой пленкой, избегая образования пузырьков воздуха. Столбик агара в пробирке должен иметь высоту около 4 см.

Когда агар затвердеет, на его поверхность с помощью капиллярной пипетки наслаивают раствор антигена, заполняющий пробирку на высоту 2—3 см, заливают парафином и оставляют при комнатной температуре.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Через определенный промежуток времени антиген диффундирует в агар. В условиях относительного избытка антигена в агаре образуется полоса преципитации, которая медленно мигрирует от границы, разделяющей агар и раствор антигена, в нижние слои агара. Миграция полосы обусловлена диффузией антигена в агаровом геле, в результате которой постепенно увеличивается концентрация антигена между полосой преципитации и верхней границей агарового слоя, т. е. выше так называемого фронта преципитации. С увеличением концентрации антигена происходит не только продвижение фронта преципитации вниз, но также и растворение преципитата у верхнего края полосы.

2. Расстояние между фронтом преципитации и верхней границей агарового слоя (h) пропорционально квадратному корню из величины, характеризующей промежуток времени от момента наслоения раствора антигена до момента учета преципитации (t). Эта зависимость позволяет рассчитать скорость миграции (k) фронта преципитации согласно следующему уравнению:

Это же уравнение позволяет, кроме того, провести количественный анализ растворов неизвестных антигенов. При низком соотношении антиген — антитело концентрации антител а и антигена g связаны следующей зависимостью:

где g₀ и а₀ — значения g и а при а у и а представляют собой коэффициенты, соответственно большие и меньшие нуля. Таким образом, скорость миграции фронта преципитации k пряма пропорциональна логарифму концентрации антигена g и обратно пропорциональна логарифму концентрации антител а.

Величина k возрастает с увеличением температуры и уменьшается с увеличением концентрации агара. При резких изменениях температуры могут появляться неспецифические преципитаты, которые, однако, не мигрируют.

Величину h выражают обычно в мм и измеряют ежедневно.