Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы иммунохимического анализа
Анализ белков методами диффузии в геле
Сравнительный анализ белков по Оссерману

Принцип метода. Если после иммуноэлектрофореза исследуемой смеси белков в одну из параллельных канавок агаровой пластинки ввести раствор известного белка, а в другую — специфическую антисыворотку к этому белку, то в месте встречи диффундирующих антигенов и антител образуется продольная полоса преципитации. Если исследуемая смесь белков содержит компонент, идентичный известному белку, то соответствующая этому компоненту полоса преципитации по краям сольется с продольной полосой, демонстрируя феномен идентичности по Ухтерлони (см. стр. 131).

Область применения. Если исследователь располагает известными белками (референс-белки) и соответствующими антисыворотками, то с помощью данного метода можно идентифицировать отдельные компоненты белковой смеси неизвестного состава.

При сравнительном анализе белков по Оссерману используются те же приборы и принадлежности, что и при иммуноэлектрофорезе (см. стр. 137).

МЕТОДИКА

1. Приготовление агаровой пластинки: см. стр. 142.

2. В середине агаровой пластинки вырезают лунку для внесения исследуемого образца, а на расстоянии 3 мм от лунки, по обе стороны от нее, делают две параллельные канавки.

3. После иммуноэлектрофореза исследуемой смеси белков (см. стр. 141) в одну канавку вносят раствор референс-белка, а во вторую заливают иммунную сыворотку к нему (на фиг. 30 — это верхняя канавка). В месте встречи компонентов этой системы, которые диффундируют в агаровом геле, образуются полосы преципитации. Если исследуемая белковая смесь имеет общие с раствором референс-белка антигены, то продольная полоса преципитации, сливаясь с теми полосами, которые появились ранее при иммуноэлектрофорезе, образует как бы продолжение последних (фиг. 30).

Фиг. 30. Сравнительный анализ белков по Оссерману [16] (объяснение см. в тексте).

ПРИМЕЧАНИЯ

Для успешного анализа белковых растворов неизвестного состава можно применять следующие методы: 1) иммуноэлектрофорез в тех случаях, когда удается идентифицировать полосы преципитации, полученные с иммунной сывороткой (фиг. 31,А); 2) метод Оссермана в тех случаях, когда исследователь располагает растворами референс-белка и соответствующей антисывороткой (фиг. 31, В); 3) метод так называемого истощения (фиг. 31, Б), который вкратце заключается в следующем.

Исследуемый белковый раствор неизвестного состава инкубируют со специфической иммунной сывороткой; образовавшийся преципитат удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость в качестве “истощенной” иммунной сыворотки используют при иммуноэлектрофорезе известной смеси белков. В полученной иммуноэлектрофореграмме будут отсутствовать именно те компоненты, которые являются общими для исследуемого белкового раствора и для известной смеси белков, так как они удалили из иммунной сыворотки соответствующие антитела.