Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы иммунохимического анализа
Анализ белков методами диффузии в геле
Абсорбционный иммуноэлектрофорез

Принцип метода. После электрофоретического разделения исследуемого белка в агаровом геле компоненты специфической иммунной сыворотки диффундируют навстречу полученным фракциям через слой агарового геля, содержащий известные (контрольные) антигены, которые абсорбируют соответствующие антитела и задерживают их дальнейшую миграцию к определяемым антигенам. В результате в образовании полос преципитации принимают участие только те антигены исследуемого образца, которые отличаются от контрольных.

Фиг. 31. Способы анализа белковой смеси с помощью иммуноэлектрофореза (подробное описание см. в тексте).

Область применения. Этот метод можно использовать для идентификации отдельных компонентов белковых смесей неизвестного состава в том случае, если исследователь располагает соответствующей иммунной сывороткой и смесью контрольных (абсорбирующих) антигенов.

МЕТОДИКА

1. Приготовление агаровой пластинки. На стеклянную пластинку размером 10 х 16 см наносят 40 мл расплавленного 1,5%-ного агара в вероналовом буферном растворе pH 8,2. Затвердевший слой агарового геля разрезают в продольном направлении таким образом, чтобы после удаления лишних участков геля на стекле осталась только полоска шириной 15 мм. Со стороны катода на расстоянии одной трети длины этой полоски геля и на равном расстоянии от ее краев делают лунку для внесения исследуемого образца диаметром примерно 5 мм и заливают в нее 1—2 капли расплавленного агара.

2. Электрофорез. После внесения исследуемого образца проводят электрофорез в течение 7—8 ч при градиенте напряжения 3 В/см.

3. Нанесение на стекло полосок геля, содержащих абсорбирующие антигены и иммунную сыворотку. По окончании электрофореза рядом с полоской геля, содержащего разделенные антигены, наливают расплавленный агар, смешанный с раствором контрольных (абсорбирующих) антигенов, таким образом, чтобы получилась вторая полоска шириной 5 мм. После затвердения нанесенного агара рядом со второй наносят третью полоску агарового геля, содержащую иммунную сыворотку. В результате на одном стекле оказываются рядом друг с другом три полоски агарового геля, образующие: а) зону специфической иммунной сыворотки, б) зону абсорбирующих антигенов и в) зону электрофоретически разделенных исследуемых антигенов.

4. Регистрация результатов. Образование полос преципитации происходит в течение нескольких дней при 4°С во влажной камере. Их появление можно зарегистрировать, фотографируя нативный или окрашенный препараты (см. стр. 135).

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Этот метод весьма полезен, например, при диагностике недостаточности синтеза иммуноглобулинов какого-либо класса. В этом случае электрофоретическому разделению подвергают нормальную сыворотку человека, в зону абсорбирующих антигенов вносят сыворотку больного, а в зону иммунной сыворотки — антисыворотку к сывороточным белкам человека. В образовании полос преципитации с фракциями нормальной сыворотки человека принимают участие только те антиглобулиновые антитела, которые не встретили соответствующих им иммуноглобулинов в сыворотке больного, диффундируя из зоны антисыворотки в зону нормальной сыворотки. В результате появляются полосы преципитации, которые соответствуют отсутствующему классу иммуноглобулинов, например IgG, IgA или IgM.

2. В полоске геля, содержащего абсорбирующие антигены, в местах образования комплексов антиген — антитело появляются прямые полосы преципитации.