Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Ионообменная хроматография пептидов
Фракционирование пептидов на колонке с дауэксом 50х2 в нелетучих буферных растворах

Принцип метода. Дауэкс 50 х 2 со сниженным количеством перекрестных сшивок в Na⁺- или NH⁺₄-форме связывает пептиды, состоящие из 2—20 аминокислотных остатков. Постепенно увеличивая pH и ионную силу подаваемого на колонку раствора, можно избирательно элюировать связанные пептиды.

Область применения. Препаративное разделение пептидов, анализ последовательности аминокислот в полипептидах и белках.

МЕТОДИКА

1. Приготовление буферных растворов¹. Аммонийформиатный буферный раствор pH 3,08 : 0,75 н. муравьиная кислота +0,2 н. NH₄OH.

Аммонийацетатный буферный раствор pH 5,06:1,47 М уксусная кислота + 1 н. NH4OH.

Натрийцитратный буферный раствор pH 3,1 : 0,1 М лимонная кислота + 0,2 и. NaOH +0,138 н. НСl.

Натрийцитратацетатный буферный раствор pH 5,1 (1 н. Na⁺): 0,25 М лимонная кислота+0,179 н. уксусная кислота+ 0,57 н. NaOH + 0,5 н. ацетат натрия.

Натрийцитратацетатный буферный раствор pH 5,1 (2 н. Na⁺): 0,5 М лимонная кислота +0,358 и. уксусная кислота + 1,14 н. NaOH + 1 н. ацетат натрия.

Натрийцитратацетатный буферный раствор pH 4,3: разбавленный в 5 раз буферный раствор pH 5,1+0,2 н. буферный раствор pH 3,1 (1:1).

¹ Указанная молярность соответствует конечной концентрации данного компонента буферного раствора.

2. Подготовка смолы. а) Получение смолы в Na⁺-форме. Смолу суспендируют в 0,25-н. НСl и перемешивают сначала при комнатной температуре, а затем при 60—70° С в водяной бане. Через 60 мин перемешивания суспензию охлаждают до комнатной температуры, надосадочную жидкость удаляют, смолу трижды отмывают дистиллированной водой и суспендируют в 0,25 н. NaOH. Полученную суспензию снова нагревают до 60—70° С в водяной бане с перемешиванием в течение 1 ч, затем охлаждают и отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции.

б) Получение смолы в NН⁺₄-форме. Сначала смолу отмывают щелочью, затем кислотой. Отмытую от хлоридов смолу в Н⁺-форме суспендируют в 0,25 н. NH₄OH, перемешивают при 60—70° С в течение 1 ч и отмывают до нейтральной реакции дистиллированной водой.

3. Заполнение колонки. В колонку размером 1,8 х 150 см, снабженную термостатирующей рубашкой, заливают немного буферного, раствора pH 3,1. Смолу суспендируют в том же буферном растворе, подогретом до 50° С, и после тщательного перемешивания освобожденную от воздуха под вакуумом суспензию загружают в колонку. Следует заполнять колонку таким образом, чтобы над смолой всегда оставалось немного буферного раствора, обеспечивающего свободное оседание частичек смолы. Заполнение заканчивают, когда уровень смолы окажется на 10 см ниже верхнего конца термостатирующей рубашки.

4. Нанесение препарата. Около 200 мг фракционируемой смеси пептидов растворяют в 25—30 мг дистиллированной воды, муравьиной кислотой подводят pH раствора до 2, затем добавляют 25—30 мл буферного раствора pH 3,1 и наносят на колонку.

5. Хроматография. Пептиды фракционируют с помощью градиентного элюирования. Стартовый буферный раствор имеет pH 3,1. Смеситель содержит 2500 мл 0,5 н. буферного раствора pH 5,1. Элюат, вытекающий из колонки, собирают фракциями по 10 мл. Нингидриновую реакцию ставят либо непосредственно с полученным элюатом, либо после его щелочного гидролиза.

Щелочной гидролиз. Из каждой фракции отбирают по 0,3 мл, перемешивают с 1 мл 2,5 н. раствора NaOH и инкубируют при 90° С в водяной бане 2,5 ч. За это время концентрация препаратов увеличивается. К каждой пробе прибавляют по 1 мл 30%-ной уксусной кислоты и проводят нингидриновую реакцию следующим образом.

В пробирки со сконцентрированными препаратами добавляют по 0,25 мл 0,2М цитратного буферного раствора pH 5, содержащего 0,2% SnCl₂, смесь перемешивают, затем к ней добавляют по 0,25 мл 4%-ного раствора нингидрина в пропаноле, помещают на 10 мин в кипящую водяную баню и охлаждают. В каждую пробирку добавляют по 3 мл 50%-ного пропанола, тщательно перемешивают и колориметрируют при 570 нм.

Из фракций элюата, соответствующих вершинам пиков, отбирают пробы и электрофорезом или методом “отпечатков пальцев” определяют их гомогенность. Если фракция негомогениа, ее подвергают рехроматографии.

Относительно рехроматографии вряд ли можно дать какие-либо определенные рекомендации. Ее условия определяются конкретным составом, а также химическими и физическими свойствами анализируемого материала. Однако, по-видимому, наиболее целесообразно вести рехроматографию на смоле в NH+4-форме в буферных растворах, содержащих ион аммония, так как в этих случаях полученные фракции содержат летучие соли и одновременно с концентрированием происходит обессоливание. Если, например, фракции элюируют аммонийацетатным буферным раствором, их сначала высушивают под вакуумом при 50° С, а затем растворяют в нескольких каплях дистиллированной воды и лиофилизируют.