Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Ионообменная хроматография пептидов
Хроматография пептидов на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

Принцип метода. Группы —СН₂—СН₂—N⁺(C₂H₆)₂ ДЭАЭ-целлюлозы обладают слабыми анионообменными свойствами в хлоридной, ацетатной и других формах.

Область применения. Аналитическое и микропрепаративное фракционирование крупных полипептидов.

МЕТОДИКА

1. Выбор типа целлюлозы. Все замечания, сделанные относительно типов КМ-целлюлозы, справедливы и для ДЭАЭ-целлюлозы (стр. 200). В дополнение к обычно рекомендуемым микрогранулярным препаратам ионообменников (например, DE 52 фирмы Whatman) мы советуем обратить внимание на сферическую ДЭАЭ-целлюлозу, изготовляемую фирмой Reanal (Венгрия).

2. Обработка ДЭАЭ-целлюлозы. Независимо от микроструктуры ионообменник обрабатывают следующим образом: сначала его перемешивают с 15-кратным количеством (сухой вес/объем) 0,5 н. НС1 30 мин при комнатной температуре и на воронке или декантацией отмывают дистиллированной водой до pH 4. После этого ДЭАЭ-целлюлозу 30 мин при комнатной температуре перемешивают с 15- кратным количеством 0,5 н. NaOH и отмывают дистиллированной водой, до тех пор пока суспензия не будет, давать нейтральной реакции. Обработанную таким образом целлюлозу уравновешивают стартовым буферным раствором.

3. Подбор условий хроматографии. Для хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, как и на КМ-целлюлозе, не существует каких-либо общих стандартных условий. Подобно тому, как это делают при хроматографии на КМ-целлюлозе, мы можем подобрать для каждого конкретного материала оптимальные условия разделения: а) изменяя pH, б) увеличивая молярность и в) одновременно увеличивая молярность и изменяя pH буферного раствора.

Обычно хроматографию начинают при pH 7,5—8,0 и при концентрации иона Сl^- или СН₃СОО^- 0,01—0,005 М и заканчивают при pH 8,0—8,5 и концентрации элюента 0,5—0,75 М. Определенные преимущества имеет градиентное элюирование.

ДЭАЭ-целлюлозу уравновешивают так же, как и КМ-целлюлозу (см. стр. 200).

ПРИМЕЧАНИЯ

Нерастворимые в воде полипептиды можно фракционировать в буферных растворах, содержащих б—8 М мочевины. Мочевину следует перекристаллизовать и обессолить на ионообменнике, поскольку соли, содержащиеся в препарате мочевины в качестве примесей, могут изменить ионную силу раствора, и хроматография станет плохо воспроизводимой. Особенно важно провести предварительную очистку мочевины, если молярность стартового буферного раствора низка (0,001—0,005 М).

Крупные полипептиды часто склонны агрегировать или вступать в ассоциации с другими компонентами. Во избежание этого, кроме мочевины, в буферный раствор можно добавлять додецилсульфат натрия в концентрации 0,1%. Однако не следует забывать, что этот детергент связывается с белками и делает полипептидные цепи устойчивыми к действию протеаз. Для удаления связавшегося додецилсульфата натрия лиофилизированные фракции отмывают ацетоном, подкисленным НСl. После такой обработки полипептиды вновь становятся чувствительными к действию протеаз.

Мелкие частицы из препаратов ДЭАЭ-целлюлозы удаляют при отстаивании суспензии и декантации надосадочной жидкости, так же как при обработке КМ-целлюлозы.

Рекомендуемая литература

Kasper С. В. in Needleman S. Р. ed., Protein Sequence Determination, p. 165— 180, Springer Verlag, Berlin Heidelberg, New York, 1970.