Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Ионообменная хроматография пептидов
Хроматография пептидов на колонке с КМ-целлюлозой

Принцип метода. Группы — СН₂СООН КМ-целлюлозы проявляют слабые катионообменные свойства.

Область применения. Фракционирование крупных пептидов для аналитических или микропрепаративных целей.

МЕТОДИКА

1. Выбор КМ-целлюлозы подходящего типа. В продаже имеется несколько типов КМ-целлюлозы. Их можно классифицировать как волокнистые, микрогранулярные и сферические. Волокнистая КМ-целлюлоза, как и другие препараты такого рода, весьма неудобна в работе. Процесс заполнения колонки ею слишком длителен, скорость элюирования с такой колонки мала, и, кроме того, основное неудобство при работе с волокнистой КМ-целлюлозой заключается в том, что ионообменник можно регенерировать только вне колонки. Микрогранулярная КМ-целлюлоза (например, препарат СМ 32 фирмы Whatman) имеет ряд преимуществ: этот ионообменник обладает очень хорошей разделяющей способностью и с ним очень удобно работать. Сферическая КМ-целлюлоза, которая прoизводится фирмой Reanal (Венгрия), обеспечивает стабильность скорости протекания жидкости через колонку и может быть регенерирована непосредственно в колонке.

2. Обработка КМ-целлюлозы. Независимо от микроструктуры КМ-целлюлозу обрабатывают следующим образом: сначала ее 30 мин перемешивают при комнатной температуре в 15-кратном (сухой вес/объем) избытке 0,5 н. NaOH, затем оставляют суспензию для отстаивания или фильтруют и отмывают дистиллированной водой до pH около 8. Отмытую целлюлозу суспендируют в 15 объемах 0,5 и. НСl, 30 мин перемешивают при комнатной температуре и отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции.

С помощью такой обработки КМ-целлюлозу удается перевести в Н⁺-форму; точно так же ее регенерируют после использования. Прежде чем начать хроматографию, необходимо уравновесить КМ-целлюлозу соответствующим “стартовым” буферным раствором.

3. Подбор условий хроматографии. Для разделения любой смеси крупных пептидов требуются индивидуальные условия фракционирования, поэтому нельзя дать рекомендаций, которые были бы применимы во всех случаях. Обычно имеются три возможности изменения условий: а) снижение pH элюента, б) изменение молярности элюента и в) одновременное изменение и pH, и молярности элюента.

При работе с КМ-целлюлозой в NH₄⁺-форме удобно реализовать возможность (в), поскольку связывание со смолой в NH₄⁺-форме довольно слабое, и это позволяет вести элюирование в мягких условиях, не повреждая полипептидные цепи. При хроматографии на КМ-целлюлозе обычно используются буферные растворы с pH 4—6,5 и молярностью 0,01—0,5 М. Если, например, в качестве стандартного раствора выбран 0,01 М аммонийацетатный буферный раствор pH 4, им же следует уравновесить КМ-целлюлозу. Однако иногда при переводе ионообменника из Н⁺-формы в NH⁺₄-форму возникают затруднения. Чтобы ускорить этот процесс, рекомендуется предварительно отмытую КМ-целлюлозу в течение по меньшей мере 10 мин перемешивать с 10 объемами стартового буферного раствора. Суспензию оставляют для отстаивания и надосадочную жидкость декантируют. Размешивание в стартовом буферном растворе повторяют до тех пор, пока pH и электропроводность надосадочной жидкости не станут стабильными. После этого заполняют колонку КМ-целлюлозой в стартовом буферном растворе и уплотняют смолу до ее конечного объема.

В аналитическом варианте на колонку размером 1 x 30 см наносят 1—10 мг фракционируемого материала. Для препаративного разделения 50—100 мг материала необходима колонка размером 2х60 см.

4. Регистрация хроматографического разделения. Если фракционируемый материал содержит относительно много тирозиновых и фенилаланиновых остатков, то довольно полную информацию о ходе хроматографии можно получить, определяя экстинкцию элюата при 280 нм (Е₂₈₀) и строя соответствующий график.

Поглощение при 220 нм характеризует пептидные связи, однако если хроматография проводится в буферном растворе, содержащем соли аммония, то ориентироваться на этот показатель нельзя.

Если концентрацию фракционируемых веществ не удается определить спектрофотометрически, то полученные фракции можно подвергнуть щелочному гидролизу и проанализировать с помощью нингидриновой реакции (см. стр. 199).

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Почти однородная волокнистая или гранулярная КМ-целлюлоза обеспечивает сравнительно постоянную скорость протекания элюента через колонку. Однако если в суспензии ионообменника содержится много мелких частиц, то колонка постепенно забивается. Поэтому рекомендуется во время подготовки и регенерации ионообменника удалять мелкие, плохо оседающие частички смолы.

2. Для хроматографии удобно пользоваться аммонийформиатным или каким-либо другим летучим буферным раствором, поскольку полученные при этом фракции после лиофилизации можно использовать без предварительного обессоливания.