Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Некоторые методологические вопросы аналитического исследования белков
Изучение нативных белков
Фракционирование белков с помощью гель-фильтрации

Разработанная Поратом и Флодиным в 1959 г. [15] гель-фильтрация явилась большим достижением в развитии фракционирования белков по молекулярному весу. Материал, используемый в этом методе в качестве неподвижной фазы, носит фирменное название сефадекс и представляет собой нерастворимый в воде высокогидрофильный декстран с поперечными сшивками, имеющий пористую структуру. Благодаря многочисленным гидрофильным группам он способен разбухать в воде и водных растворах солей, образуя гель, который может выполнять роль молекулярного сита при разделении веществ разного молекулярного веса. Размер пор этого сита определяется частотой поперечных сшивок в декстране. Чем ближе друг к другу расположены поперечные сшивки, тем плотнее пространственный каркас геля и соответственно меньше способность сефадекса связывать воду.

Если раствор, содержащий вещества различного молекулярного веса, пропустить через колонку, заполненную гелем сефадекса, то более мелкие молекулы проникнут во внутреннюю часть гель-образующих гранул и в результате их миграция через колонку будет замедлена. В то же время вещества большего молекулярного веса не проникают внутрь гранул геля и мигрируют быстрее мелких молекул. Разные скорости миграции приводят к разделению веществ при их прохождении через “молекулярные сита”.

Фирма Pharmacia (Швеция) выпускает 18 типов сефадексов (без ионообменных свойств), которые отличаются друг от друга частотой поперечных сшивок. Важнейшие свойства сефадексов приведены в табл. 2. Символ, указывающий тип сефадекса (G-25, G-50 и т. д.), обозначает пористую структуру (G) и величину поглощения воды на грамм сухого веса сефадекса, т. е. указывает частоту поперечных сшивок декстрана. У сефадексов с высоким значением индекса цифра указывает нижний предел молекулярного веса веществ (в тысячах), не проникающих внутрь гранул геля. Например, вещества с молекулярным весом меньше.100 000 могут проникать внутрь гранул сефадекса G-100, тогда как вещества с более крупными молекулами выходят в свободном объеме раствора.

Благодаря перечисленным выше свойствам сефадексы интенсивно используются при изучении структуры белков. Чаще всего их применяют для разделения белков в зависимости от молекулярного веса, для очистки белковых фракций, для концентрирования разбавленных растворов белка и для обессоливания белковых препаратов.

Гель-фильтрация все шире используется для фракционирования белков сыворотки. Наиболее подходящим в данном случае является сефадекс G-200. С колонки этого геля белки сыворотки элюируются тремя пиками. Первый пик соответствует в основном липопротеидам и макроглобулинам, вторым пиком выходит IgG, в третьем пике содержатся главным образом альбумин и трансферрин. В принципе гель-фильтрацию на G-200 можно использовать и для выделения иммуноглобулинов.

Таблица 2 Типы сефадексов

С 1962 г. в хроматографии стали применять полиакриламидные гели [5,81. Фирма Bio-Rad Laboratories выпускает более 30 гелей для хроматографии под коммерческим названием биогели (табл. 3). Сухие биогели, подобно сефадексам, набухают в воде и имеют такие же свойства в диапазоне pH от 2 до 11. Первое сообщение о гель-хроматографии в агаре в 1961 г. сделал Полсон [14]. Главной особенностью гелей агара и агарозы является пригодность для фракционирования веществ с большим молекулярным весом, которые не удается разделить на сефадексе G-200 или биогеле Р-300.

Агар и агароза при нагревании становятся жидкими. В связи с этим их гели при температуре выше 50° С теряют стабильность. Их нельзя использовать при pH ниже 4,5 и выше 9,0; поэтому при работе с этими гелями крайне важно соблюдать указания изготовителя относительно температуры и величины pH. В продаже имеются следующие гели агарозы: сагавак (фирма Seravac Laboratories, сефароза (фирма Pharmacia Fine Chemicals), гелароза (фирма Litex) и биогель А (фирма Bio-Rad Laboratories).

Таблица 3 Типы биогелей